Pcr的發(fā)展史課件

1、Pcr的發(fā)展史專業(yè)：作物遺傳育種姓名：李宇峰背景Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想:“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。但由于當時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上70年代初分子克隆技術的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴增基因的途徑，所以，Khorana的設想被人們遺忘了。Pcr的原理及反應體系原理： DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝

2、。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。反應體系Pcr的發(fā)展過程Pcr的實現(xiàn)：1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。Pcr的改善：（1）Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的K

3、lenow片段，其缺點是：Klenow酶不耐高溫， 90會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。引物鏈延伸反應在37下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度 (2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應用。 樣式不同的pcr儀Pcr的四個技術革新第一代：機械手式水浴箱基因擴增三個水浴箱恒定三個溫度，94 58 72優(yōu)點：設備簡單，費用低，試驗時間段，更接近pcr理想狀態(tài)。缺點：勞動強度大，易出錯第三代：終點定量優(yōu)點：可以評價待定核算的濃度及定量分析第四代：實時定量pcr實時定量Qpcr儀+實時定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量監(jiān)測系統(tǒng)研究意義PCR技術問世以來正以驚人的速度發(fā)展，不僅其本身不斷地優(yōu)化改進，許多新型的PCR技術或由PCR衍生的新技術正不斷出現(xiàn)。在PCR技術的啟發(fā)下，諸如轉錄依賴的擴增系統(tǒng)(TAS)、連接酶鏈反應(LCR)、自主序列復制系統(tǒng)(3SR)、鏈替代擴增(SDA)、循環(huán)探針反應、等溫擴增系統(tǒng)等