乙肝兩對半定性測定課件

1、乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。2021/4/272乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定HBVHBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人

2、死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。2021/4/272HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不乙肝病毒血清標(biāo)志物HBsAg第一個(gè)出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性陽性表示存在HBV感染HBsAb出現(xiàn)在HBsAg消失后保護(hù)性抗體疫苗免疫成功的標(biāo)志 2021/4/273乙肝病毒血清標(biāo)志物HBsAg2021/4/273乙肝病毒血清標(biāo)志物HBeAg病毒復(fù)制標(biāo)志傳染性強(qiáng)HBeAb 傳染性降低長期存在是DNA與肝細(xì)胞整合的結(jié)果2021/4/274乙肝病毒血清標(biāo)志物HBeAg2021/4/274乙肝病毒血清標(biāo)志物HBcAg

3、 HBV復(fù)制的標(biāo)志血清中難以檢測出來IgM-HBcAb 急性HBV感染IgG-HBcAb急性感染恢復(fù)期和慢性持續(xù)感染2021/4/275乙肝病毒血清標(biāo)志物HBcAg 2021/4/275檢測HBV病毒血清標(biāo)志物是臨床最常用的病原學(xué)診斷方法。HBV具有三個(gè)抗原抗體系統(tǒng)，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗體（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗體（HBcAb），由于HBcAg在血液中難于檢出，故臨床免疫學(xué)檢測不包括HBcAg，目前常采用酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法檢測。2021/4/276檢測HBV病毒血清標(biāo)志物是臨床最常用的病原學(xué)診斷方法。HBV

4、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標(biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。2021/4/277酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測原理血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中

5、和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)2021/4/278乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測原理血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物標(biāo)本本要求采集： 血漿：使用抗凝血漿管（枸櫞酸鹽、EDTA鹽、肝素之一為抗凝劑）采集樣品。樣品離心分離后，提取血漿用于檢測。 血清：采用正確醫(yī)用技術(shù)采集標(biāo)本。離心分離后，提取血清樣品用于檢測。2021/4/279標(biāo)本本要求采集：2021/4/279標(biāo)本要求儲(chǔ)存：樣品可存放于28冰箱，24小時(shí)內(nèi)測定。若需長時(shí)間保存，則應(yīng)凍存于-20以下，避免反復(fù)凍融。上述樣品使用前應(yīng)恢復(fù)到室溫，輕輕搖動(dòng)混勻。若標(biāo)本有沉淀物形成，應(yīng)離心除去，并確定未變質(zhì)方可使用。嚴(yán)重融

6、血或脂血標(biāo)本不可使用。2021/4/2710標(biāo)本要求儲(chǔ)存：樣品可存放于28冰箱，24小時(shí)內(nèi)測定。若需試劑（安圖生物）編號(hào)組分名稱96人份1包被板69孔X1塊2樣品稀釋液2.3ml X1瓶3酶結(jié)合物5.5ml X1瓶4底物液6.2ml X1瓶5顯色劑6.2ml X1瓶6洗滌液30ml X1瓶7終止液5.5ml X1瓶8陰性對照1.0ml X1瓶9陽性對照1.0ml X1瓶10子母袋1個(gè)11說明書1份12板貼3張主要組成成分2021/4/2711試劑（安圖生物）編號(hào)組分名稱96人份1包被板69孔X1塊2實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室溫（1825）。2.將恒溫箱或水浴鍋

7、調(diào)至反應(yīng)溫度。3.洗液用蒸餾水作20倍稀釋后備用。2021/4/2712實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室檢驗(yàn)步驟排板2021/4/2713檢驗(yàn)步驟排板2021/4/2713檢驗(yàn)步驟表面抗原（兩步法）1.留一孔作空白對照，加入樣本稀釋液20ul/孔（含空白孔），其他加入陰性對照三孔和陽性對照二孔100ul/孔及待測標(biāo)本100ul/孔于相應(yīng)的反應(yīng)孔內(nèi)。2.在微型真當(dāng)器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。3.貼上板貼，置37下溫育60分鐘。2021/4/2714檢驗(yàn)步驟表面抗原（兩步法）2021/4/2714檢驗(yàn)步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物

8、50ul。5.在微型振蕩器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。6.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。7.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。8.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光溫育30分鐘。2021/4/2715檢驗(yàn)步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。檢驗(yàn)步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。10.使用酶標(biāo)儀450nm單波長測量各孔的OD值。2021/4/2716檢驗(yàn)步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)檢驗(yàn)步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）1.留一孔空白，三孔加入陰性對照、二孔加入陽性對照各5

9、0ul/孔，其他各孔分別加入樣本50ul (HBcAb測定時(shí)待測血清用生理鹽水1:30稀釋50ul血清+1.5ml生理鹽水) 。2.除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。3.在微型真當(dāng)器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。4.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。2021/4/2717檢驗(yàn)步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）2021檢驗(yàn)步驟5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。6.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光反應(yīng)10分鐘。7.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。8.使用酶標(biāo)儀450nm單波長測量各孔的OD值。2021/4/2718檢驗(yàn)步驟

10、5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。20212021/4/27192021/4/27192021/4/27202021/4/27202021/4/27212021/4/2721結(jié)果判定血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)1.肉眼判定2021/4/2722結(jié)果判定血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg結(jié)果判定2.酶標(biāo)儀判定：用酶

11、標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值，根據(jù)OD值判定結(jié)果2021/4/2723結(jié)果判定2.酶標(biāo)儀判定：用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長45注意事項(xiàng)濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本時(shí)要加到孔底。加試劑前應(yīng)將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應(yīng)棄去1-2滴。2021/4/2724注意事項(xiàng)濃縮洗滌液配制前充分搖勻。2021/4/2724注意事項(xiàng)滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時(shí)各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時(shí)注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果。2021/4/2725注意事項(xiàng)滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。勿將

12、試劑滴在孔壁注意事項(xiàng)所有樣本都應(yīng)按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關(guān)。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。不同品名、不同批號(hào)的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。2021/4/2726注意事項(xiàng)所有樣本都應(yīng)按傳染源處理。2021/4/2726影響檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響 1.1 標(biāo)本嚴(yán)重溶血。 1.2 標(biāo)本凝固不全：血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋原。2、試劑的影響 2.1 不同批號(hào)。 2.2 不同廠家。2021/4/2727影響檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響2021/4/27影響檢測結(jié)果的因素3.操作技術(shù)的

13、影響 3.1 加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測結(jié)果。 3.2 溫浴影響。 3.3 手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動(dòng)與全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果。2021/4/2728影響檢測結(jié)果的因素3.操作技術(shù)的影響2021/4/2728常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV復(fù)制，傳染性強(qiáng)大三陽+急性HBV感染趨向恢復(fù)；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱小三陽+急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱+慢性HBsAg攜帶者易轉(zhuǎn)陰；急性HBV感染趨向恢復(fù)+急性HBV感染早期或慢性攜帶者，傳染性強(qiáng)+急性HBV感染早期；急性HBV感染潛伏期；慢性HBV攜帶者，傳染性弱2021/4/2729常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbH常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+非典型性或亞臨床型HBV感染+注射過乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假陽性+急性HBV感染后康復(fù)+HBV感染后已恢復(fù)+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢復(fù)期+既往感染未能測出HBsAb；恢復(fù)期HBsAg已消，HBsAb尚未出現(xiàn)；無癥狀HBsAg攜帶者過去和現(xiàn)在未感染過HBV2021/4/2730常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHB