細胞周期醫(yī)學知識課件

1、Chen（Chen, 2009）提出聯合使用黃芩素和水飛薊素，對肝癌HepG2細胞顯示良好的殺傷作用，對正常肝細胞（Chang liver）活性沒有影響，兩種藥物聯合應用增加了G0/G1期細胞的百分率，減少了S期細胞的百分率，上調了Rb、p53、Cip1/p21和Kip1/p27蛋白，下調了Cyclin D1、Cyclin E、CDK4和phospho-Rb。 Chen L, Willis S N, Wei A, et al. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allow

2、s complementary apoptotic function. Mol Cell, 2005, 17(3): 393-403Varghese（Varghese, 2005）采用肝癌HepG2和 Hep3B細胞研究水飛薊賓的抗腫瘤作用，發(fā)現水飛薊賓強烈抑制HepG2和Hep3B細胞增殖，且對Hep3B細胞的增殖抑制效果更強。對于HepG2細胞，水飛薊賓導致G1期阻滯；對于Hep3B 細胞，導致G1 和G2-M 阻滯。對于這2種細胞，水飛薊賓誘導Kip1/p27表達，減少cyclin D1、cyclin D3、cyclin E、CDK2和CDK4表達水平。 Varghese L, Agar

3、wal C, yagi A, Singh RP, Agarwal R. Silibinin efficacy against human hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2005,23(11):8441-8448. Chen（Chen, 2009）提出聯合使用黃芩素和水飛薊素PI單染流式細胞儀檢測細胞周期百分比（n=3）組別 G0/G1期 S期 G2/M期ControlRODN(1.0mol/L)ASODN(0.75mol/L)ASODN(1.0mol/L)47.400.5048.300.3040.100.36*33.270.47*49.5

4、00.3048.600.3658.900.30*63.830.38*3.100.203.070.250.970.062.900.10注：*與RODN組相比，P 0.01 PI單染流式細胞儀檢測細胞周期百分比（n=3） G0第一部分：細胞周期概況： 間期：G0，G1，S，G2 分裂期：M2. 實驗發(fā)現一些蛋白和激酶調控細胞周期第一部分：細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束所經歷的整個過程。G0細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結細胞周期與DNA合成正常的細胞周期分為間期（interphase）和有絲分裂期(M phase)。其中間期 以DNA合成

5、為標志。分為：G0期（即靜止狀態(tài)），G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期）G2期（合成其它必需的物質）細胞周期與DNA合成正常的細胞周期分為間期（interphaG1SG2MG1周期性運轉，在間期細胞體積增大(生長)，M 期細胞 先核分裂，接著胞質分裂，G1SG2MG1周期性運轉， 在間期細胞體積增大(生長)， S期 DNA 復制， M 期細胞 先核分裂，接著胞質分裂， 完成一個細胞周期。G1SG2MG1周期性運轉，G1期時期:從有絲分裂結束到DNA合成開始之間。 First Gap 有絲分裂后期，子細胞繼續(xù)生長時期。時間:變化大,幾小時-幾天 人體 200 多種細胞，周期時間不同,主

6、要在 G1。 如：胚胎早期卵裂細胞 幾乎測不到G1期 淋巴細胞 數小時 神經元細胞 終生停在G1期G1期時期:從有絲分裂結束到DNA合成開始之間。特點：能對各種環(huán)境信號,進行綜合協調，并作出反應，以確定是否進入S期。事件：細胞生長主要階段。合成組蛋白、非組蛋白、一些酶類、一定量的RNA，還有微管蛋白和抑素。 這些蛋白即觸發(fā)蛋白，積累到一定程度，可通過G1期檢查點，進入S期。 抑素：與細胞停止在G1期有關。特點：能對各種環(huán)境信號,進行綜合協調，并作出反應，以確定是否S期DNA合成期基本特點：（1）復制DNA，為分裂作準備 （2） 合成組蛋白和非組蛋白。時間：約10 h左右形態(tài)：細胞增大S期末，D

7、NA加倍。 完成DNA復制，才能入M期。S期DNA合成期特點： (1) 主要為DNA合成： 開始時，急劇形成DNA聚合酶及 4 種脫氧核苷酸以后，合成DNA等。 Bao和Johnson，采用Hela細胞。把G1期細胞與S期細胞融合，引起G1期細胞核合成DNA。融合的S期細胞越多，G1期細胞合成DNA的速度越快。 S期細胞中有一種誘導物質，能促進DNA的合成。 (2) S期的蛋白質合成：合成組蛋白和非組蛋白。 DNA復制過程中需不斷合成蛋白質，組蛋白的合成和DNA的復制密切配合。Gurlez和Hardin： （1）用藥物阻斷蛋白質合成（如加入環(huán)己酰胺），幾秒鐘后DNA合成停止。（2）用藥物抑制D

8、NA合成（如加入阿霉素），組蛋白合成立即停止，非組蛋白合成不受影響。特點：G2期 時期:分裂之前 時間：較短，約2 - 3 h 多數細胞休止于G1期，也有細胞休止于G2期，如少數休眠的種子細胞。特點：主要合成分裂有關的蛋白質，尤以細胞骨架蛋白。 如阻止蛋白質合成，細胞不進入分裂。G2期 時期:分裂之前M期 時期：最終階段基本特點：形態(tài)、結構變化最大，細胞增殖標志時間：短，較恒定分期：前期、中期、后期，末期 M期 時期：最終階段前期prophase染色質凝集，核膜崩解，紡綞體形成特點： 1.染色體組裝：染色質疑集，M期開始。分裂前染色質逐漸變短，變粗，成染色體，每個復制的染色體形成一對姐妹染色體

9、（sister chromatics）。2.紡綞體形成：中心粒:2套中心粒分離,向兩極移動成為紡綞體的兩個極，是微管組織中心(MTOC)。3.核膜崩解，前期結束。前期prophaseM期-中期要點: 紡綞體及赤道板形成 特點: 紡綞體：已形成，穩(wěn)定 染色體：高度濃縮，形成中期板(赤道板)細胞形狀：圓形、易脫落M期-中期M期后期要點: 后期開始染色單體分離，分別移動到相反的紡錘體極。 細胞形狀：略變長。 M期后期M期末期要點:細胞質分裂，形成2個子細胞 特點胞質中重新出現正常結構，紡綞體消失。新的核膜形成，染色體解螺旋化形成染色質。胞質分裂cytokinesis：形成特殊臨時性結構：收縮環(huán)， 細

10、胞膜內陷， 生成2個子細胞 。每個子細胞含有一套完整的染色體，細胞則完成一個周期，進入下一個間期。 M期末期M期細胞的有絲分裂M期細胞的有絲分裂典型的真核生物細胞周期都有2個特征：生長和細胞分裂。人迅速分裂的細胞經整個細胞周期要24 h： G1:7 h; S :10 h; G2:4.5 h; M:0.5 h一些細胞可以暫時離開細胞周期，進入G0期，處于G0期的細胞不分裂，也不生長。典型的真核生物細胞周期都有2個特征：生長和細胞分裂。0h 4h12h 20h0h 4h細胞周期醫(yī)學知識課件第一部分：細胞周期概況： 間期：G0，G1，S，G2 分裂期：M2. 實驗發(fā)現一些蛋白和激酶調控細胞周期 MP

11、F的發(fā)現：PCC：prematurely condensed chromosome 染色體超前凝集MFP：mitosis-promoting factors 細胞促分裂因子APC：anaphage promoting complex 細胞分裂后期促進復合物第一部分：MPF的發(fā)現及其作用:MPF,即卵細胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或促細胞分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促進因子(M phase-promoting factor).背景一: Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細胞同步于不同

12、階段，然后與M期細胞在滅活仙臺病毒介導下誘導細胞融合，發(fā)現與M期細胞融合的間期細胞產生了形態(tài)各異的染色體凝集，稱之為染色體超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如圖所示:MPF的發(fā)現及其作用:MPF,即卵細胞促成熟因子(maturG1期PCC為單線狀，因DNA未復制;S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復制G2期PCC為雙線染色體DNA復制已完成PCC：染色體超前凝集這就意味著M期細胞具有某種促進間期細胞進行分裂的因子，稱為細胞促分裂因子mitosis-promoting factor 。G1期PCC為單線狀，因DNA未復制;S期PCC為粉

13、末狀，G人M期細胞與袋鼠的G1、S、G2期細胞融合誘導PCC：同類M期細胞可以誘導PCC，不同類的M期細胞也可以誘導PCC產生:PCC：染色體超前凝集人M期細胞與袋鼠的G1、S、G2期細胞融合誘導PCC：同類MPF,即卵細胞 促成熟因子(maturation-promoting factor), 或促細胞分裂因子(mitosis-promoting factor),背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做實驗，明確提出了MPF這一概念。非洲爪蟾卵母細胞在其卵巢里發(fā)育，它們復制DNA，然后在G2期停滯8個月。受到雄性刺激后，卵巢細胞分泌孕酮，刺激G2期細胞進行第一次減數分裂和第

14、二次減數分裂，停滯在第二次減數分裂中期，稱為卵子（egg）。 實驗：（1）取一個G2期的卵母細胞，孕酮處理，誘導它成熟為卵細胞。 （2）利用一微針頭將停滯在第二次減數分裂中期的卵細胞（M期）的胞漿5%轉移到另一個處于G2停滯期的卵母細胞，促進這個卵母細胞(G2期)發(fā)育成熟。MPF,即卵細胞 促成熟因子(maturation-pro因此，在成熟卵細胞的細胞質中必然有一種物質，可以誘導卵母細胞成熟，稱之為促成熟因子，MPF。MPF: 卵細胞促成熟因子(maturation-promoting factor), 因此，在成熟卵細胞的細胞質中必然有一種物質，可以誘導卵母細胞分離純化出MPF：直到198

15、8年，Maller實驗室的Lohka等人才以非洲爪蟾為材料，分離得到了微克級的純化的MPF。證明其含有p32和p45兩種蛋白。二者結合后表現出蛋白激酶活性，可以使多種蛋白質底物磷酸化。證明，MPF是一種蛋白激酶。分離純化出MPF：直到1988年，Maller實驗室的Loh p34cdc2激酶的發(fā)現及其與MPF的關系：另一批生物學家以酵母為材料，從另一個側面對細胞周期調控進行著深入研究.如：L.Hartwell以芽殖酵母為實驗材料；如：P.Nurse 以裂殖酵母為實驗材料。 p34cdc2激酶的發(fā)現及其與MPF的關系：另一批生物學P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現的cdc2基因就是第一個被分離出來的

16、cdc基因。其表達產物是一種相對分子量為34103的蛋白，被稱為p34cdc2。進一步研究發(fā)現，p34cdc2具有激酶活性，可使多種蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期調控中起關鍵性調節(jié)作用。 L.Hartwell在芽殖酵母中發(fā)現的cdc28基因是第二個被分離出的cdc基因，其表達產物也是一種相對分子量為34103的蛋白，被稱為p34cdc28。它也是一種蛋白激酶，在G2/M轉換過程中起中心調節(jié)作用。這些與細胞分裂和周期調控有關的基因被稱為 (cell division cycle) cdc基因，根據被發(fā)現的先后順序被命名。P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現的cdc2基因就是第一個被分離很快Maller

17、Nurse證明：MPF中的p34cdc28 可以被p34cdc2特異抗體所識別，并且p34cdc2可以加速MPF活性，表明二者是同源物。p34cdc2與p34cdc28是同源物。（脊椎動物MPF的催化亞單位是CDK1，在裂殖酵母為CDC2，芽生酵母為CDC28。）進一步研究發(fā)現： p34cdc2或p34cdc28本身并不具有激酶活性，只有當其與有關蛋白結合后，其激酶活性才能夠表現出來。例如： p34cdc2必須與另一種蛋白p56cdc13結合后才具有激酶活性。很快MallerNurse證明：MPF中的p34cdc28在研究酵母的同時，以Tim Hunt為代表的另一批科學家正在以海膽卵為材料，對

18、細胞周期調控進行著深入研究。他們發(fā)現：有兩種蛋白質的含量隨細胞周期進程的變化而變化，一般在細胞間期內積累，在細胞分裂期內消失，在下一個周期中又重復這一消長現象。因此稱這兩種蛋白為細胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分離和克隆出來，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補性。MallerHunt合作證明：MPF中的另一種成分是周期蛋白B。序列分析證明，周期蛋白B與酵母的p56cdc13是同源物。周期蛋白B: Cyclin B在研究酵母的同時，以Tim Hunt為代表的另一批科學家正在Cyclin B的性質P468實驗：卵（M期）提取物影響精子染色質（間期）的周期改變。

19、（1）加入未經處理的蟾蜍卵提取物，使精子染色質存在細胞周期事件；（2）加入RNA酶水解的卵提取物，使精子染色質未見細胞周期事件。（3）當RNA酶處理卵提取物 + 野生型cyclinB mRNA，精子染色質的周期重現。（4）當加入RNA酶處理卵提取物加不能降解的cyclinB mRNA，精子染色質致密化，核膜溶解。但有絲分裂晚期事件染色體去致密化和核膜形成都不發(fā)生。說明： 卵提取物中Cyclin B對細胞周期必需。 且：cyclin B降解 對精子染色質的細胞周期結束是必需的。Cyclin B的性質P468實驗：卵（M期）提取物影響精子Cyclin B的降解：Cyclin B的N端含有destr

20、uction box，破壞框后面有Lys殘基，結合泛素。細胞分裂后期促進復合物（anaphase promoting complex, APC）MPF (CDC2+ cyclinB ) 活性在分裂中期達到高峰。激活APC，cyclin B多泛素化，導致cyclin B降解，使MPF失活，進入下一個周期。Cyclin B在細胞周期中連續(xù)合成，但是在有絲分裂的間期活性升高，在有絲分裂晚期突然下降。Cyclin B的降解：Cyclin B的N端含有destr由此MPF的生化成分得到確定： （催化亞單位）（調節(jié)亞單位）酵母的p56cdc13p34cdc28CDK1MPF = p34cdc2 + cyc

21、linB由此MPF的生化成分得到確定： （催化亞單位）（調節(jié)亞2001年10月8日美國人LelandHartwell、英國人Paul Nurse、TimothyHunt因對細胞周期調控機理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎2001年10月8日美國人LelandHartwell、英MPF = p34cdc2 + cyclinBMPF = p34cdc2 + cyclinB細胞周期調控的主要分子機制細胞周期的內源性調控主要是通過“Cyclins-CDKs-CKIs”這一調控網絡。細胞周期內源性調控Cyclins CDKs -CKIs正性調控核心負性調控CDKs（cyclin-dependent kina

22、se）CKIs（CDK inhibitor）細胞周期調控的主要分子機制細胞周期的內源性調控主要是通過“C 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調控網絡 Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時相而出現 CDKs 不同時相 (而出現)4. G1S期轉折5. G2M期轉折6. CKIs 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調控網絡Cyclins（細胞周期蛋白）對CDKs具有正性調控作用CDKs（cyclin-dependent kinase，細胞周期蛋白依賴性激酶）是調控網絡的核心CKIs（CDK inhibitor，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子）具有負

23、性調控作用。3. Cyclins-CDKs-CKIs調控網絡周期蛋白 cyclins：自1983年首次發(fā)現周期蛋白后，許多科學家紛紛開展周期蛋白研究，短短10年就從各種生物中克隆分離了數十種周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等動物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H 等等。各種周期蛋白均含有100個左右的保守氨基酸序列，稱為周期蛋白框，它可介導周期蛋白cyclins與CDK結合。 周期蛋白 cyclins：自1983年首次發(fā)現周期蛋白后，許部分周期蛋白分子結構特征 圖中除Cln3外，均為人的周期蛋白分子。所有這些分子均含有一個周期

24、蛋白框，結合CDK 。部分周期蛋白分子結構特征 圖中除Cln3外，均為人的周期蛋白周期蛋白(A, B)分子的N端含有破壞框。Destruction box 的下游含lys殘基，可結合多個泛素。周期蛋白(A, B)分子的N端含有破壞框。Destructi細胞周期蛋白的破壞框與降解途徑細胞周期蛋白的破壞框與降解途徑Cyclin D，C，E等含有：PEST序列 (一個富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、絲氨酸(S)和蘇氨酸（T）殘基的PEST序列，與泛素結合而降解。Cyclin D，C，E等含有：PEST序列 (一個富含脯氨各種細胞周期蛋白隨特定細胞時相而出現。 G1早期，cyclin

25、D表達并與CDK4或CDK6結合，成為始動細胞周期的啟動子； G1晚期、進入S早期后cyclin E表達，并與CDK2結合，推動細胞進入S期； 進入S期后，cyclin A表達，并與CDK2結合，cyclin D、cyclin E降解； S晚期、G2早期，cyclin A表達，cyclin B表達，并與cdc2結合，促進細胞進入M期。各種細胞周期蛋白隨特定細胞時相而出現。細胞周期醫(yī)學知識課件Cyclins（細胞周期蛋白）對CDKs具有正性調控作用。CDKs（cyclin-dependent kinase，細胞周期蛋白依賴性激酶）是調控網絡的核心。CKIs（CDK inhibitor，細胞周期蛋

26、白依賴性激酶抑制因子）具有負性調控作用。Cyclins（細胞周期蛋白）對CDKs具有正性調控作用。CDK人們對CDK的認識，最初是通過研究培養(yǎng)細胞和酵母細胞而得到的。目前已經確定的CDK有：裂殖酵母中CdC2；釀酒酵母中的CdC28、PHO85、KIN28以及人類細胞中CDK110 。是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要生物學作用是促進細胞周期時相轉變、推進細胞周期運行，CDK和其調節(jié)因子又被稱作細胞周期引擎。異常可能導致腫瘤的發(fā)生。CDK人們對CDK的認識，最初是通過研究培養(yǎng)細胞和酵母細胞而CDK的分子量一般為3540kD，不同CDK的氨基酸組成有40%以上的同源性。典型的CDK催化亞基

27、的活性中心約由300個氨基酸殘基組成，當處于單體或非磷酸化狀態(tài)時，CDK沒有催化活性。 CDK含有一段保守氨基酸序列-PSTAIRE，與周期蛋白cyclins的結合有關。CDK的分子量一般為3540kD，不同CDK的氨基酸組成有細胞周期醫(yī)學知識課件CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調節(jié)。在激活因素中，目前認為CDK與周期素的結合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸化是較為重要的兩種調節(jié)因素而在抑制因素中，CDK的 N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的結合是主要的調節(jié)因素。Regulation of CDK ActivityCDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調節(jié)。Regu

28、周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”結構域直接和CDK的結合，并與CDK的激活相關，周期素是CDK的正性調節(jié)劑。周期素的結合與激活作用主要通過周期素在細胞周期中的濃度波動來調控。磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依賴于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）中的Thr161和CDK2中的Thr160的磷酸化，就與這兩個酶的激活相關。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調節(jié)亞基為周期素H。Activation of CDK 周期素的激活作用：Activation of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：在人的CDK1和CDK

29、2中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14磷酸化的為蛋白激酶Wee1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Myt1。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相對活性，決定CDK1和CDK2的活性高低。Inhibition of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：Inhibition of CDK細胞周期醫(yī)學知識課件Regulation of CDK ActivityCDK7Regulation of CDK ActivityCDK7抑制蛋白的抑制作用：近年來，已分離并鑒定了若干能夠與周期素-C

30、DK復合物特異性結合并抑制其活性的蛋白因子，這些蛋白因子被稱為周期素依賴性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）。大部分CKI都是抑癌基因的編碼產物。在哺乳動物細胞中，目前已經確定的CKI主要有： P16INK4、P15INK4B 、P21WAF1/CIP1、P27KIP1 。P16INK4和P15INK4B 抑制CDK4,CDK6的活性。P21WAF1/CIP1、P27KIP1抑制CDK2的活性，P21WAF1/CIP1抑制CDK1的活性。抑制蛋白的抑制作用：cdc2cdc2小結：Cyclins與CDKG1期Cyclin D表達，并與CDK 4、CDK6結合，使下游的蛋白質如Rb磷酸化，然后釋放出轉錄因

31、子E2F，促進其他Cyclin和CDK的轉錄；在G1/S期， Cyclin E與CDK2結合，促進細胞進入S期。進入S期后，Cyclin E降解，CDK2轉而與Cyclin A結合，推進細胞進入G2期；在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結合，導致染色體凝縮，核膜解體等, 促進細胞進入M期。在M期，激活后期促進復合物APC（anaphase promoting complex），將泛素連接在Cyclin B上，導致Cyclin B被蛋白酶體降解、失活，結束M 期。DEAB小結：Cyclins與CDKG1期Cyclin D表達，并與 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調控

32、網絡 Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時相而出現 CDKs 不同時相而出現4. G1S期轉折5. G2M期轉折6. CKIs 第二部分4. G1期到S期的轉折，DNA的復制。14-3-34. G1期到S期的轉折，DNA的復制。14-3-3（一） G1期胞周期蛋白（ G1-cyclin）作用在G1期或G1/S交界期，啟動細胞周期和促進DNA合成的cyclin，G1期是增殖細胞唯一能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號的時期。cyclin D ： cyclin D1 ，cyclinD2 ，cyclin D3 cyclin C cyclin E ：cyclin E 1，cycl

33、in E 2 Cyclin A（一） G1期胞周期蛋白（ G1-cyclin）cyclin D首先在酵母菌中被發(fā)現，它能激活CDK6，它有3個亞型，包括D1、D2、D3，具組織特異性。周期素D的C-端存在一個PEST序列。 N-端含有一個共同順序Leu-X-Cys-X-Glu ，是周期素D與p110Rb等蛋白結合所必需。 cyclin D1在G1中期合成達到高峰。 cyclin D1的功能主要是促進細胞增殖。Cyclin D2峰值在G1晚期，給G1期細胞微量注射cyclin D2抗體，可使表達cyclin D2的淋巴細胞停滯在G1期。說明： cyclin D2是細胞從G1期向S期轉移所必須的。

34、cyclin D首先在酵母菌中被發(fā)現，它能激活CDK6，它有不同亞型周期素D在細胞內的表達模式不同，但主要是在G1期處于較高的表達水平。不同亞型周期素D在細胞內的表達模式不同，但主要是在G1期處于cyclin E在cyclin D之后出現。 cyclin E基因及其產物的表達在細胞周期的G1中期上升，至G1晚期或S早期達高峰，在G1晚期發(fā)揮正調控細胞周期的作用。cyclin A：cyclin A在cyclin E之后很快表達。cyclin A是G1期向S期轉移的限速因素。cyclin E在cyclin D之后出現。Rb蛋白與E2F轉錄因子Rb蛋白與E2F轉錄因子Rb基因 Rb是CDK 4/6-

35、Cyclin D， CDK2-Cyclin E的底物。Rb基因位于人類染色體13q14，其轉錄產物Rb蛋白在細胞周期中起制動器功能。它能與轉錄因子E2F結合并阻止相應基因轉錄表達，從而抑制細胞生長。 Rb (p110), Rb相關蛋白p107，p130抑制E2F的轉錄活性。Rb基因細胞周期醫(yī)學知識課件細胞轉錄因子（E2F ）在許多DNA合成基因和細胞生長調控基因的啟動子中均含有E2F的位點，E2F可以直接活化這些基因，啟動DNA合成使細胞進入S期。在E2F基因活化轉錄功能區(qū)內有一段18個氨基酸的序列可與Rb結合，Rb通過與E2F功能區(qū)的結合遮蓋E2F功能區(qū)，抑制E2F轉錄功能，抑制DNA合成。

36、細胞轉錄因子（E2F ）有絲分裂原刺激G0期細胞，促進CDK 4/6, Cyclin D, E2F 的轉錄。Cyclin D表達，并與CDK 4/6結合，使下游的蛋白質如Rb磷酸化，然后釋放出轉錄因子E2F。E2F促進E2F、CDK2，Cyclin E，A表達。G1晚期， CDK2，Cyclin E進一步磷酸化更多的Rb，釋放更多的E2F，促進更多的E2F、CDK2，Cyclin E，A表達，形成正反饋。 CDK2-Cyclin E和E2F相互正性調節(jié)。E2F的活化有絲分裂原刺激G0期細胞，促進CDK 4/6, CyclinG1期Cyclin D表達，并與CDK 4、CDK6結合，使下游的蛋白

37、質如Rb磷酸化，然后釋放出轉錄因子E2F，促進其他Cyclin和CDK的轉錄；在G1/S期， cyclinE與CDK2結合，促進細胞進入S期。進入S期后，Cyclin E降解，CDK2轉而與CyclinA結合，推進細胞進入G2期；小結：G1期Cyclin D表達，并與CDK 4、CDK6結合，使 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調控網絡 Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時相而出現 CDKs 不同時相而出現4. G1S期轉折5. G2M期轉折6. CKIs 第二部分5. G2/M轉折和有絲分裂的調控5. G2/M轉折和有絲分裂的調控 G2 M期細胞周期蛋白

38、 在G2M交界期誘導細胞分裂的cyclin。即在G2M期轉換處發(fā)揮作用，誘導細胞分裂的周期素，包括周期素A、B兩種。這類蛋白在其N-端含有一個降解盒，在M期通過泛素（ubiquitin）途徑降解。 cyclin A、cyclin B在M期通過泛素途徑降解，這是細胞脫離有絲分裂所必須。 G2 M期細胞周期蛋白1、cyclin A：cyclin A在cyclin E之后很快表達。cyclin A是G1期向S期轉移的限速因素，也可促進細胞從G2期向M期的轉化。2、cyclin B：哺乳動物cyclin B在S晚期合成，在G2期濃度升高，在M早期達到最高。能促進G2期向M期的過渡。 1、cyclin

39、A：cyclin A在cyclin E之后cyclin A含量在S期及G2期初最高，cyclin B在G2期末含量最高；cyclin A與CDK2，CDK1結合，cyclin B與CDK1結合；cyclin A在S期發(fā)揮作用，與DNA的復制完成有關cyclin B在G2M交界期發(fā)揮作用，誘發(fā)細胞分裂及細胞分裂進展。cyclin A、cyclin B的區(qū)別：cyclin A、cyclin B的區(qū)別：CDK磷酸化修飾的激活作用：人CDK1（p34cdc2）中的Thr161和CDK2中的Thr160的磷酸化。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調節(jié)亞基為

40、周期素H。磷酸化修飾的抑制作用：人的CDK1中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14磷酸化的為蛋白激酶Wee1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Myt1。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。CDK磷酸化修飾的激活作用：在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結合，作用于核纖層蛋白（lamins）、驅動蛋白（kinesin），參與DNA致密化的蛋白，泛素依賴的蛋白降解系統等，導致染色體凝縮，核膜解體等，促進細胞進入M期。CDK1的活化：當ATP結合部位14thr和15Tyr磷酸化，抑制。 但14thr和15tyr去磷酸化，活化。CD

41、C25活化CDK1-Cyclin B，CDK1-Cyclin B活化PLK1，PLK1活化CDC25，形成正反饋。Wee1、Myt1抑制CDK1-Cyclin B。CDK1-Cyclin B活化PLK1，PLK1抑制Weel， Wee1抑制CDK1-Cyclin B 。CDC25被chk1，chk2抑制，也可因結合14-3-3而失活。DNA損傷，chk1，chk2活化，抑制CDC25，阻礙CDK1-Cyclin B，抑制細胞進入M期。在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結合，作用于核細胞周期醫(yī)學知識課件 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調控網絡 Cyclins-CDK

42、s 相互配合 Cyclins 不同時相而出現 CDKs 不同時相而出現4. G1S期轉折5. G2M期轉折6. CKIs 第二部分6. CKIs可阻止細胞通過檢驗點，其作用方式是直接與CDK或cyclin-CDK復合物結合，已發(fā)現的CKI有p16家族和 p21家族p16家族又稱INK4家族（inhibitors of kinase 4） P16, P15, P18, P19 特異性抑制 CDK4, CDK6。特異性抑制cdk4cyclin D1、cdk6cyclin D1復合物。P21家族又稱CIP（CDK inhibitory protein）/KIP家族 P21, P27, P57 抑制大

43、多數 CDK 活性。P21cip/waf1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結合，直接抑制DNA的合成。14-3-36. CKIs可阻止細胞通過檢驗點，其作用方式是直接與CDKINK4家族的CKIINK家族的CKI包括p16(INK4a), p15(INK4b), p18(INK4c), P19(INK4d)INK4家族的蛋白識別CDK4和CDK6，但不識別CDK2，通過 與Cyclin D競爭結合CDK4而引起G1期停滯。1、 p16(INK4a) p16 INK4是CDK4的特異性抑制物，可與CDK4或CDK6的結合，抑制cyclin D- CDK4/6復合物的作用，競爭抑制CDK4對細

44、胞生長分裂的正向作用，參與抑制細胞周期G1S的轉化。 p16啟動子甲基化是該基因沉默的主要機制。INK4家族的CKI2、p15 INKb p15位于9號染色體緊鄰p16的區(qū)域，它與p16一樣屬抑癌基因。高甲基化引起p15滅活常見于白血病和淋巴瘤。P15抑制CDK4/6.調節(jié)：Miz1（myc interacting zinc finger protein 1）能結合p15啟動子的起始成分，增加p15的表達，引起細胞G1期阻滯，抑制Cyclin D的激酶活性。 c-Myc 拮抗這一作用。TGF-激活p15的表達，減少c-Myc的表達，解除c-Myc對Miz1的抑制作用，增加p15的轉錄。c-My

45、c和Max、Miz1在p15啟動子的起始部位形成復合物，抑制p15表達。 2、p15 INKb 復制衰老復制衰老CIP/ KIPs家族的CKIs： p21、P27、p57等，CIP/ KIPs家族的CKIs： p21、P27、p57等P27/KIP1是由抑癌基因KIP1編碼合成的蛋白質，P27抑制CDK2-Cyclin E活性，阻滯細胞與G1期。激活p27：PTEN增加p27的表達，抑制p27的泛素化，提高其穩(wěn)定性。Forkhead轉錄因子（Afx，Fkhr (FOXO1)）激活p27的轉錄。FKHR (FoxO1), a member of the FoxO subfamily of for

46、khead transcription factors, is an important target for insulin and growth factor signaling in the regulation of metabolism, cell cycle and proliferation, and survival in peripheral tissues抑制p27 ：p27啟動子甲基化c-Myc阻礙p27與CDK2-Cyclin E的結合，間接抑制p27。Her2激活Akt，Akt結合和磷酸化p27，阻滯p27向核內轉位。 Her2激活Akt，Akt抑制FoxO1/3，F

47、oxO1/3轉錄激活p21，p27。Her2間接抑制p21，p27。P27/KIP1P21/CIP1是由抑癌基因WAF1/CIP1編碼合成的蛋白質，幾乎能與所有的周期素-CDK復合物結合，抑制其蛋白激酶活性，啟動子上有p53結合位點。P21表達導致G1期阻滯和G2/M期阻滯。激活p21：P53轉錄激活p21.鈣調蛋白促進p21核轉移。抑制p21 ： C-Myc抑制p21Her2激活Akt，Akt結合和磷酸化p21，阻滯p21向核內轉位。 Her2激活Akt， Akt抑制Foxo1/3，Foxo1/3轉錄激活p21，p27。Her2間接抑制p21，p27。P21/CIP1細胞周期醫(yī)學知識課件14

48、-3-3P53誘導14-3-3表達，14-3-3可以直接提高P53的轉錄活性，形成正反饋環(huán)。14-3-3可結合cdc25，并將之輸出胞核，抑制CDK1-cyclinB的作用。14-3-3結合CDK1，并將之輸出胞核，抑制CDK1與cyclinB的結合。抑制細胞進入M期，使細胞有更多的時間進行DNA修復。 P57 主要抑制cyclinD2/ CDK2, cyclinE2/CDK2, cyclinA2/CDK2, 阻止細胞通過G1/ S 轉變.14-3-3P57 主要抑制cyclinD2/ CDK2,哺乳動物至少有3 種Cdc25 同源物，分別為Cdc25A、Cdc25B 和Cdc25C。Cdc2

49、5A 主要在G1/S 期轉變中起作用，Cdc25B 在S 期被激活，進而在細胞質中激活CDK1/ cyclinB，活化的CDK1/ cyclinB 激活Cdc25C，通過正反饋機制調控有絲分裂。哺乳動物至少有3 種Cdc25 同源物，分別為Cdc25A、細胞周期醫(yī)學知識課件第三部分 7.細胞周期調節(jié)的關卡checkpoint （1）G1和G2期阻滯 G1期關卡： G1期關卡反應的二重波模型 G2期關卡： G2期關卡反應的二重波模型 （2） S期關卡 （3）有絲分裂紡錘體關卡(spindle assembly checkpoint，SAC) 8. 細胞周期調控異常與腫瘤 9. 細胞周期調控的抗腫

50、瘤藥物第三部分7.細胞周期調節(jié)的關卡checkpoint細胞受到損害或細胞周期的前一步驟尚未完成時，細胞周期會停滯并修正這些事件；然后繼續(xù)細胞周期，這些調節(jié)機制稱為關卡調控（check point control）。Cyclins-CDKs-CKIs”網絡調控細胞周期的運行，還必須在一系列稱為檢驗點(checkpoint)的嚴格檢控下進行的。細胞周期檢驗點由感受異常事件的感受器、信號傳導通路和效應器構成。7.細胞周期調節(jié)的關卡checkpoint細胞受到損害或細胞主要檢驗點包括:G1/S檢驗點，S期檢驗點，G2/M檢驗點，紡錘體組裝檢驗點(spindle assembly checkpoint

51、，SAC）。主要檢驗點包括:細胞周期調控檢驗點組成感受器、信號傳導通路、效應器G1/SDNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？SDNA復制是否完成？G2/MDNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？SAC紡錘體組裝檢驗點；中-后期檢驗點主要檢驗點細胞周期調控檢驗點組成感受器、信號傳導通路、效應器G1/SD一、G1和G2期阻滯當紫外線、射線或化學修飾使DNA受到損傷，細胞停滯在G1和G2期，直到損傷得到修復。P53可使受損的DNA停滯在G1期或G2期。損傷的DNA使p53穩(wěn)定，濃度增加，激活p21，p21與CDK2-cyclinE、CDC2-cyclinB結合，使細胞停滯在G1或G2期

52、。p53促進puma、Noxa，Bax的表達，促進細胞凋亡。G1期關卡反應的二重波模型（two wave model） 一開始迅速短暫的p53非依賴的反應，導致細胞周期停滯，接著延緩的持續(xù)的p53-p21軸引起G1期停滯。一、G1和G2期阻滯當紫外線、射線或化學修飾使DNA受到損 UV或IR-DNA損傷-ATM/ATR活化-Chk1，Chk2磷酸化活化-抑制CDC25活性（Cdc25磷酸化，結合泛素，而降解）毛細血管擴張性共濟失調突變基因 ataxia-telangiectasia mutated gene, ATM). 毛細血管擴張性共濟失調相關基因 (ataxia-telangiectas

53、ia related gene, ATR). ATM 和ATR 屬于三磷酸肌醇激酶家族的成員, 分別感應不同形式的DNA 損傷, ATM 主要在雙鏈DNA 損傷時發(fā)揮“檢測點”的作用, ATR則負責感應并傳導其他形式的DNA 損傷, 包括復制叉損傷、DNA 交聯等;這兩個激酶被DNA 損傷激活后, 分別磷酸化下游底物如CHK1、CHK2、p53 等,將損傷信號向下一級信號分子傳遞. UV或IR-DNA損傷-ATM/A細胞周期醫(yī)學知識課件ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進CDC25A的ser123, ser178,ser292磷酸化，導致cdc25A泛素化降解，使細胞周期停止

54、于G1期。ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進CDC25C的ser216磷酸化，導致cdc25C與14-3-3結合，運輸至胞液。不能活化cdc2.ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進ATMP53在正常細胞中表達很少，且非常MDM2作為E3連接酶，介導p53降解。P53促進MDM2轉錄。此負反饋回來使細胞內MDM2/ p53比例保持恒定。MDM2（1）介導p53穿過核膜進入胞漿降解，（2）抑制p53的轉錄活性。DNA損傷，ATM使MDM2（ser386,395,425,428，Thr419）磷酸化，ATR使MDM2（ser407）磷酸化，ATM磷酸化c-AB1

55、激酶，進而磷酸化MDM2（Tyr276,394）。 MDM2磷酸化使其E3連接酶活性喪失。P53在正常細胞中表達很少，且非常MDM2作為E3連接酶，介DNA損傷，ATM使p53（ser15）磷酸化，CHk2使p53（ser20）磷酸化，ATR使p53（ser15，37）磷酸化活化。P53 （ser20， Thr18）的磷酸化可顯著降低p53-MDM2的相互作用，抑制MDM2介導的降解。 P53 （ser15，20， Thr18）的磷酸化可封閉p53核輸出信號區(qū)域，阻止p53被輸出核外。P300/CREB結合蛋白（CBP）使p53（lys373,382,305）乙?；?。PCAF使 p53（lys

56、320）乙?；?。 p53乙?；稍黾觩53的轉錄活性。DNA損傷，ATM使p53（ser15）磷酸化，CHk2使pG1期關卡反應的二重波模型（two wave model） 一開始：迅速短暫的p53非依賴的反應，導致細胞周期停滯： UV或IR-DNA損傷-ATM/ATR活化-Chk1，Chk2磷酸化活化-抑制CDC25A活性（Cdc25A磷酸化，結合泛素，而降解）-抑制CDK2/ cyclinE活性，抑制DNA復制前復合物，抑制DNA復制，細胞周期停滯于G1期。G1期關卡反應的二重波模型（two wave model） 二重波模型 其次： 延緩持續(xù)的p53-p21軸引起G1期停滯。 DNA損傷

57、，ATM/ATR活化，促進p53磷酸化活化； 或促進Chk1磷酸化，進而磷酸化p53 （ser15，37） 。 或促進Chk2磷酸化，進而磷酸化p53 （ser20） ； 并解除MDM4、MDM2對p53的抑制，使p53游離。 另外ATM磷酸化MDM2，磷酸化p53，抑制p53向胞外輸出，促進p53在核內發(fā)揮作用。 p53轉錄激活p21，p21結合cyclinE-CDK2，抑制其活性，促進G1期停滯。另外，IR促進cyclinD1的泛素化降解，使p21-cyclinD1-CDK4復合物解離，p21轉而結合cyclinE-CDK2，抑制其活性，細胞停滯于G1期。 細胞周期醫(yī)學知識課件P53與G2

58、期停滯：二重波理論同樣適用于G2期阻滯。首先：DNA損傷，ATM/ATR活化，Chk1，Chk2活化，抑制Cdc25活性（使CDC25C的ser216磷酸化，與14-3-3 結合而轉移到胞漿），抑制cyclinB-CDK1，細胞周期停滯。其次：ATM/ATR活化，促進p53活化。P53下調CyclinB1的表達。P53促進p21轉錄，p21抑制cyclin B-CDK1活性，使細胞停滯于G2期。P53促進 GADD45轉錄，抑制cyclin B-CDK1活性。P53誘導14-3-3表達，14-3-3結合CDK1并將之輸出胞核，抑制CDK1與cyclinB的結合?；蚪Y合CDC25C并將之輸出胞核

59、，抑制CDK1 活性。14-3-3蛋白可以直接提高P53的轉錄活性，形成一個正反饋環(huán)。P53與G2期停滯：細胞周期醫(yī)學知識課件二 、S期關卡 抑制DNA的合成，使 S期延長，而不是永久的停滯。S期關卡是短暫現象。 IR-DNA斷裂-ATM活化-磷酸化Chk2-促進Cdc25A磷酸化，并泛素化降解-抑制CDK2/Cyclin E，導致s期延遲。二 、S期關卡三、有絲分裂紡錘體組裝不完全導致細胞分裂后期停滯有絲分裂紡錘體關卡(spindle assembly checkpoint，SAC)，與MPF活性調節(jié)有關。監(jiān)測：微管與動粒的附著、紡錘體兩極通過微管附著姐妹染色體產生的張力。當關卡調控感知到有

60、絲分裂紡錘體組裝不完全時，就會防止APC多泛素化系統的激活。APC多泛素化系統激活受阻，導致MPF保持高活性，染色體保持致密化，核膜不能重新形成。細胞分裂后期促進復合物（anaphase promoting complex, APC）三、有絲分裂紡錘體組裝不完全導致細胞分裂后期停滯細胞分裂后期第三部分 7.細胞周期調節(jié)的關卡checkpoint （1）G1和G2期阻滯 G1期關卡： G1期關卡反應的二重波模型 G2期關卡： G2期關卡反應的二重波模型 （2） S期關卡 （3）有絲分裂紡錘體關卡(spindle assembly checkpoint，SAC) 8. 細胞周期調控異常與腫瘤 9.