免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座培訓(xùn)課件

1、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座非標(biāo)記抗體免疫酶法(1969 Sternberger )一、酶橋法（抗酶抗體法）二、PAP法 (1970Sternkerger 等）三、雙PAP法（1975Vaeca 等）四、APAAP多聚螯合物酶法2免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座非標(biāo)記抗體免疫酶法(1969 Sternberger )一、非標(biāo)記抗體免疫酶法Sternberger （1969）在酶標(biāo)抗體法的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了非標(biāo)記抗體免疫酶技術(shù)。酶標(biāo)抗體，酶與抗體的結(jié)合可損害部分抗體和酶的活性，從而降低了抗體的效價。另外，血清中的非特異性抗體也可以被酶標(biāo)記，這些非特異酶標(biāo)記抗體與組織中相

2、應(yīng)抗原結(jié)合，放大了非特異背景染色。3免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座非標(biāo)記抗體免疫酶法Sternberger （1969）在酶標(biāo)非標(biāo)記抗體免疫酶法先用酶（HRP 或AKP）去免疫動物（羊、兔和鼠等），使其產(chǎn)生高效價、特異性的抗酶抗體，再將該抗酶抗體與酶結(jié)合，形成五環(huán)的復(fù)合物，沒有一個抗體受到共價鍵的標(biāo)記，保留了免疫活性，相對分子質(zhì)量較小，對細(xì)胞的穿透性好。4免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座非標(biāo)記抗體免疫酶法先用酶（HRP 或AKP）去免疫動物（羊、一、酶橋法原理：抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與第三抗體連接起來，形成酶聯(lián)的抗原-抗體復(fù)合物，加底物顯色。

3、反應(yīng)層次（四步法）： 抗原第一抗體 第二抗體（橋抗體） 抗酶抗體 HRP DAB+H2O2 有色沉淀物 5免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座一、酶橋法原理：抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體）酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP底物酶橋法6免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP底物酶橋法注意點(diǎn)第一步橋抗體必須對特異性抗體（一抗）、抗酶抗體，均具特異性，才能連接兩者抗原特異性抗體、抗酶抗體由同一種屬動物產(chǎn)生第二步橋抗體應(yīng)過量，當(dāng)與特異性一抗結(jié)合后，仍有剩余的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使結(jié)合抗酶抗體，最后使酶通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合7

4、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座酶橋法注意點(diǎn)7免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座酶橋法特點(diǎn) 用抗酶抗體 采用免疫反應(yīng)原理（避免化學(xué)交聯(lián)對酶抗體活性的影響） 一抗與抗酶抗體為同一種動物 二抗作為橋抗體連接二種IgG （ 同種動物） 優(yōu)點(diǎn) 對酶活性及抗體效價影響小 非特異性染色比間接法輕 提高了靈敏度 缺點(diǎn) 手續(xù)較多，時間長 8免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座酶橋法特點(diǎn) 8免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座染色步驟1）4）同酶標(biāo)抗體直接法。5）適當(dāng)稀釋的特異性一抗（例如來自種屬A ) 37 孵育60min 或4過夜，PBS 洗33min。6）第二抗體（也稱橋抗體，抗種屬A 的IgG 抗體）37 孵育40min

5、，PBS洗33min。7）抗酶抗體（來自種屬A ) 37 孵育40min，PBS 洗3x3min。8）酶（HRP 70100g/ml，PBS 溶解）37 孵育40min，PBS 洗3x3min。9）顯色復(fù)染同酶標(biāo)抗體直接法。因該方法比PAP 法麻煩，現(xiàn)已被PAP 法所取代，故很少應(yīng)用。9免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座染色步驟9免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座二、PAP法酶橋法雖克服了酶標(biāo)記抗體法的某些缺點(diǎn)，有效地保護(hù)了抗體及酶的活性，但抗酶抗體必須高度純化，否則將降低其敏感性。一是由于抗酶抗體血清中含有高親和力和低親和力兩種抗酶抗體抗酶抗體血清中的非特異性抗體雖不能與酶結(jié)合，但能與第二抗體（橋抗

6、體）結(jié)合，從而減少了抗酶抗體的結(jié)合，也影響到方法的敏感性。10免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座二、PAP法酶橋法雖克服了酶標(biāo)記抗體法的某些缺點(diǎn)，有效地保護(hù)PAP法Sternkerger 等（1970 ）在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，建立了辣根過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法原理：抗原-特異性抗體-第二抗體（橋抗體）-PAP復(fù)合物步驟：三步法 將酶橋法的第，步合并為，用復(fù)合物代替現(xiàn)將抗酶抗體和酶可溶性酶復(fù)合物常用事先制備好的PAP進(jìn)行免疫酶染色故稱PAP法（現(xiàn)有試劑：鼠、兔、羊PAP）11免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座PAP法Sternkerger 等（1970 ）在此基礎(chǔ)上進(jìn)組織抗原第一抗原第二抗體PAP

7、復(fù)合物HRP底物PAP法12免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP底物PAP法12免PAP法酶與抗體的比例個酶分子與個抗酶抗體結(jié)合形成亞單位構(gòu)成環(huán)形體優(yōu)點(diǎn) 抗原稍過量，所有的抗HRP 抗體均參與形成可溶性PAP 復(fù)合物 敏感性高 背景著色低（PAP 為復(fù)合物，不存在游離免疫球蛋白） 步驟簡化（染色） 缺點(diǎn) PAP 制備復(fù)雜，步驟多，時間長 13免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座PAP法酶與抗體的比例13免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座染色步驟1） 4m 石蠟切片58 烤片4h，切片常規(guī)脫蠟至水。2）蛋白酶消化或AR （組織抗原的暴露或抗原的修復(fù)，此步視情況而定）。3

8、）0.3 % H2O2 處理切片20min （室溫），PBS 洗3min2次4）3正常動物血清處理切片30min （室溫），吸去多余血清，不洗。5）適當(dāng)稀釋的特異性一抗孵育（4 過夜或37 60min) ，PBS洗3min3 次6）滴加橋抗體（二抗），37 孵育40min，PBS 洗3min3。7）適當(dāng)稀釋的PAP 復(fù)合物（要求與特異性一抗同一種屬）37 孵育40min。8）PBS 洗3min 3。9）0.04 % DAB-0.03 % H2O2顯色812min。10）水洗、復(fù)染、脫水、樹膠封片，結(jié)果觀察 注：根據(jù)具體情況可省略2）、3）步驟。14免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座染色步驟14免疫

9、酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座三、雙PAP法原理：Vaeca 等（1975）建立了雙PAP 法（double bridge PAP method） ，其基本原理是在PAP 法的基礎(chǔ)上重復(fù)第二抗體和PAP 復(fù)合物，重復(fù)的連接抗體和PAP 復(fù)合物可能有兩種連接方式抗原-特異性抗體-第二抗體（橋抗體）-PAP -第二抗體- PAP復(fù)合物15免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座三、雙PAP法原理：Vaeca 等（1975）建立了雙PAP組織抗原第一抗體第二抗體PAP復(fù)合物HRP雙PAP法第一種重復(fù)連接抗體與特異性一抗分子上未飽和的Fc 段相結(jié)合，第一抗體上結(jié)合了更多的橋抗體和PAP 復(fù)合物。16免疫酶組織化學(xué)技

10、術(shù)專業(yè)知識講座組織抗原第一抗體第二抗體PAP復(fù)合物HRP雙PAP法第一種雙PAP法雙PAP法組織抗原第一抗體第二抗體PAP復(fù)合物HRP第二種重復(fù)連接抗體可與一個PAP 中的抗HRP 抗體上未飽和的Fc段結(jié)合，再與后加的PAP 復(fù)合物相結(jié)合17免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座雙PAP法雙PAP法組織抗原第一抗體第二抗體PAP復(fù)合物HR雙PAP法步驟：五步法 特點(diǎn)：敏感性較高缺點(diǎn)：但步驟多，費(fèi)時，非特異背景重其染色步驟是在單PAP 法步驟18）的基礎(chǔ)上重復(fù)68）步，然后繼續(xù)以下操作。9）常規(guī)DAB-H2O2顯色。10）水洗、復(fù)染、脫水、封片。注：根據(jù)具體情況可省略2）、3）步驟。18免疫酶組織化學(xué)技

11、術(shù)專業(yè)知識講座雙PAP法步驟：五步法 18免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座四、APAAP法免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)是以堿性磷酸酶（AKP 或AP）取代HRP 來顯示結(jié)果的免疫酶組織化學(xué)技術(shù)。1983 年Moson及Moir等建立了堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶( APAAP ）復(fù)合物法。19免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座四、APAAP法免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)是以堿性磷酸酶（A免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座培訓(xùn)課件APAAP法21免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座APAAP法21免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座APAAP法注意點(diǎn)（同PAP 法） 一抗與第三抗必須來源于同一種屬動物 二抗必須過量 優(yōu)點(diǎn) AL

12、P 免疫組化染色，不受內(nèi)源性過氧化物酶干擾，處理內(nèi)源性ALP 較易 紅色易與色素顆粒區(qū)別（用堅(jiān)牢紅時） 應(yīng)用 含豐富內(nèi)源性過氧化物酶的冷凍切片的首選方法（淋巴組織、腫瘤組織） 皮膚病理學(xué)中應(yīng)用，可與黑色素相區(qū)別 22免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座APAAP法注意點(diǎn)（同PAP 法） 22免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專多聚螯合物酶法許多年來，很多研究者都在努力使IHC 方法更敏感、更穩(wěn)定、更簡單，要求多步檢測系統(tǒng)簡化，但敏感性要進(jìn)一步提高，使這一技術(shù)面臨巨大的挑戰(zhàn)。一種新的多聚贅合物酶二步法在1995 年被隆重推出，該方法與簡單的二步法相比較，具有很高的敏感性、穩(wěn)定性和特異性。23免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識

13、講座多聚螯合物酶法許多年來，很多研究者都在努力使IHC 方法更敏多聚螯合物酶法 HRP-多聚螯合物-抗體 以碳為骨架 以多聚糖 以氨基酸類為骨架主要用于PowerVision 法，它可以折疊，其復(fù)合物顆粒小于EnVision 試劑，其敏感性好于EnVision 法。主要用于UIP （universal immunoperoxidase polymer ）法，其敏感性基本與PowerVision 法相同。24免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座多聚螯合物酶法 HRP-多聚螯合物-抗體 主要用于多聚螯合物酶法25免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座多聚螯合物酶法25免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座多聚螯合物酶法

14、一、EPOS法 Enhanced polymer one-step staining原理：以具有惰性的多聚螯合物（葡聚糖）為骨架，將特異性抗體和HRP結(jié)合在一起，形成特異性EPOS試劑，一步法完成26免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座多聚螯合物酶法一、EPOS法26免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講EPOS法原理：形成HRP-多聚化合物-特異性抗體巨大復(fù)合物，該復(fù)合物內(nèi)不含第二抗體及親和素，染色時，只需在組織切片上加入相應(yīng)的酶標(biāo)記特異性抗體EPOS 試劑，孵育3060min 即可完成。勿需再加酶標(biāo)記第二抗體27免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座EPOS法原理：形成HRP-多聚化合物-特異性抗體巨大復(fù)合物EP

15、OS法組織抗原一抗HRP多聚骨架28免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座EPOS法組織抗原一抗HRP多聚骨架28免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專EPOS 法操作流程如下。 1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS 洗3min3 次。2）蛋白酶消化或抗原修復(fù)（AR ) ，PBS 洗3minx3 次。3）0.3 過氧過氫（H2O2）處理5min。4）蒸餾水洗，置于PBS 中洗5min。5）加入相應(yīng)的Dako EPOS / HRP 試劑，室溫孵育3060min。6） PBS 洗3min 3 次。7）0.04% DAB-0.03% H2O2 顯色812min。8）水洗，復(fù)染，常規(guī)樹膠封片。29免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座EP

16、OS 法操作流程如下。 29免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講EPOS法步驟：一步法特點(diǎn)：目前最簡便的方法，快速，特異性強(qiáng)，基本無背景染色 ，敏感性高 但商品化種類不全， 價格昂貴30免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座EPOS法步驟：一步法30免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座二、EnVision法（ELPS法）Enhanced Labelled Polymer System原理：抗原抗體反應(yīng)結(jié)合后，第二抗體上標(biāo)記有多聚化合物（葡聚糖）酶復(fù)合物（EnVision 復(fù)合物），與第一抗體結(jié)合，進(jìn)而由酶作用底物進(jìn)行顯色定位。31免疫酶組織化學(xué)技術(shù)專業(yè)知識講座二、EnVision法（ELPS法）Enhanced Lab組織抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步32免疫酶組織化學(xué)技