信號轉導研究方法課件

1、信號轉導研究方法1. 蛋白質表達水平和細胞內定位研究 Methods to measure changes in steady-state levels or sizes of specific proteins: Western blot analysis. Methods to measure changes in protein localization within a cell: Immunohistochemistry / Immunocytochemistry Immunofluorescence (IF) Green fluorescent protein (GFP and i

2、ts derivatives)-fusion proteintypically, live cells.操作過程SDS電泳 轉膜（PVDF或硝酸纖維素膜） 封閉 一抗 洗滌 標記二抗 洗滌 顯色或化學發(fā)光顯影硝酸纖維素膜目的蛋白質抗目的蛋白一抗標記的二抗偶聯的堿性磷酸酶磷酸化生色體系脫磷酸顯色采用Western blot方法檢測蛋白質原理示意圖Fig. Activation of PPAR mediates curcumin suppression of the gene expression of EGFR in Moser cells. To study the effect of cur

3、cumin on the expression of EGFR and to elucidate the underlying mechanism, preconfluent Moser cells were pretreated with or without PD-68235 (10 M) for 30 min before addition of curcumin at indicated concentrations for an additional 8 h. Whole cell protein extracts were prepared for Western blot ana

4、lyses. -Actin was used as an internal control for equal protein loading.2. 蛋白質與蛋白質相互作用的研究技術: Co-elution or co-purification through sucrose or glycerol gradients, affinity columns, gel filtration columns, ion exchange columns Co-IP with antibody against one protein followed by Western blot with antib

5、ody against another protein GST pull-down assay Yeast or mammalian two-hybrid assay FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay Double IFto assess co-localization of different proteinsagarose bead IP 是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“protein A”能特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象而開發(fā)出來的方法。目前多用精制的protein A預先結合固化在aga

6、rose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗體達到沉淀抗原的目的。protein A抗原抗體Western Blot和質譜分析GST融合蛋白進行Pulldown實驗GST pull-down assay 原理 將GST融合蛋白(tagged protein (標記蛋白) or the bait (餌蛋白)，GST, His6, Flag, biotin )作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白(test protein, or prey被撲獲蛋白)結合，然后根據谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在發(fā)現

7、抗體干擾蛋白質蛋白質之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術。該方法只是用于確定體外的相互作用。GST-Pulldown Assay 熒光共振能量轉移(FRET)是對生物大分子之間相互作用定性、定量檢測的一種有效方法，是在活體細胞中實時地對生物大分子之間的相互作用進行動態(tài)監(jiān)測. 兩個攜帶不同熒光基團（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互間距離足夠近時會發(fā)生激發(fā)態(tài)能量非放射性地由一個熒光基團（供體）向另一個熒光基團（受體）轉移的現象。如果發(fā)生FRET，則供體信號將淬滅而受體信號將激活或增強. FRET 檢測系統可以快速高效地捕獲來自標定分子間相互作用的短暫微弱的熒光信號，而以分子尺度分辨出

8、供體-受體的平均距離，并能顯示出受體-供體的相互作用。 蛋白質直接相互作用的熒光共振能量轉移 Fluorescence Resonance Energy Transfer Double IF 3. 磷酸化蛋白質研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. Changes in mobility in SDS(often but not always seen). Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. 激酶活性

9、的測定信號轉導過程中往往涉及多種激酶的活化，因而對這些激酶活性的測定在信號轉導研究中具有重要意義。常見激酶活性的測定有PTK、PKC、PKC及PI-3K等。均有商品化的試劑盒。4. 基因表達或轉錄活性檢測 Methods to measure changes in steady-state levels of specific mRNAs: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. RNase protection assay (RPA). “gene chip” to measure changes in gene expressi

10、on at larger scales (e.g. genome-wide). Methods to measure transcriptional activity of specific promoter/enhancer: Transient or stable reporter assayluciferase (Luc) or choramphenicolacetyltransferase (CAT，氯霉素乙酰轉移酶基因). Nuclear run-on assay5. 蛋白質與DNA相互作用的研究技術: Gel shift (or electrophoretic mobility s

11、hift) assay (EMSA)typically, with smaller DNA sizes (10s of base pairs). Chromatin-immunoprecipitation (ChIP) assayto assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells. Gel shift甲醛處理使蛋白質與DNA交聯；超聲波將染色質打斷成一定大??；通過抗體沉淀蛋白質-DNA交聯復合體；解除交聯，純化DNA；分析6. 基因或蛋白質功能研究 改變基因結構 基因突變（點突變、缺失、融合等） 將突變基

12、因或蛋白引入細胞以檢測其功能Dominant negative mutants (缺失結構域突變體)Ligand-binding sitePhosphorylation siteDocking siteProtein-protein binding siteDNA binding site長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶切成個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA小干擾性RNA與細胞源性的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體，該復合體可識別與小干擾RNA有同源序列的RNA，并在特異的位點將該RNA切斷。 轉基因transgenic：1）將人工分離和修飾過的基因導

13、入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉基因。轉基因動物：所謂轉基因動物就是指以實驗方法將外源基因導入動物染色體基因組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物?；蚯贸╧nock-out）采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應正?；?再應用轉基因方法孵育出轉基因動物,即為基因敲除動物。 信號轉導中第二信使含量的測定第二信使含量的高低同信號傳遞密切相關。1.Ca2+的測定：原子光譜法、離子微電極測定法、放射示蹤法及標記示蹤法等。目前常用標記示蹤法，即用熒光探針標記靶細胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后二者較為敏感。2.IP3的測定：采用3H-TdR標記的肌醇標記靶細胞后，用不同的刺激劑刺激細胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過陰離子交換層析柱分離洗脫，收集IP3洗脫峰后進行液閃測定。此外，還可以使用Amersham公司生產的D-myo-IP33H分析系統直接測定