儀器及藥物分析熒光質(zhì)譜

1、第二節(jié) 光學(xué)分析一、原子吸收光譜二、紫外 可見分光光度法三、紅外分光光度法四、熒光分光光度法五、有機(jī)質(zhì)譜法1五、熒光分子光度法（一）基本原理（二）熒光分光光度計(jì)（三）特點(diǎn)、方法與應(yīng)用2熒光（fluorescence）現(xiàn)象的第一次記錄： 1575年，西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N. Monardes，觀察到Lignum Nephriticum木頭切片的水溶液呈現(xiàn)天藍(lán)色。第一次被提議用于分析： 1864年，Stokes第一次用于分析： 1867年，Goppelsrder根據(jù)Al-桑色素配合物的熒光，建立了Al3+的熒光測定方法。3當(dāng)物質(zhì)分子吸收了一定波長的紫外光能之后，基態(tài) 電子躍遷到第一激發(fā)態(tài)，處于

2、激發(fā)態(tài)的電子首先以 無輻射的方式下降到第一激發(fā)態(tài)的低能級，而后再 回到基態(tài)時(shí)，所發(fā)射出的光稱為熒光。熒光是一種以光能為激發(fā)源的發(fā)射光，且波長比激 發(fā)態(tài)波長更長，所以，利用物質(zhì)的熒光現(xiàn)象而建立 的分析方法稱為熒光分光光度法。（一）基本原理45熒光定量分析原理熒光是由物質(zhì)在吸收光能之后產(chǎn)生的發(fā)射光，其熒光強(qiáng)度 與物質(zhì)吸收光能的程度和產(chǎn)生熒光的物質(zhì)有關(guān)。熒光效率 反映熒光強(qiáng)度的重要參數(shù)熒光強(qiáng)度 If 應(yīng)與熒光物質(zhì)的吸光強(qiáng)度( I0 I )和熒光效率成正比，即 If = ( I0 I )根據(jù)朗伯 比爾定律，和有關(guān)的運(yùn)算，在一定的條件下， 得： If = 2.3 I0cl = Kc 6（二）熒光分析光度

3、計(jì)光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測器信號(hào)處理顯示I0 IfI7熒光分光光度計(jì)部件1光源：鎢燈、汞燈、氙燈、激光 激發(fā)光源應(yīng)具有穩(wěn)定性好、強(qiáng)度大、適用波長范圍寬等特點(diǎn)。其中穩(wěn)定性：影響測定的重現(xiàn)性和精密度；強(qiáng)度：影響測定的靈敏度。2單色器：濾光片、光柵 激發(fā)單色器和發(fā)射單色器3檢測器PMT PhotomultiplierCCD Charge Coupled Device CID Charge Injected Device 4信號(hào)處理8 Jobin Yvon Fluorolog-3 熒光光譜儀1. 穩(wěn)態(tài)： S/N min 4000:1(光子計(jì)數(shù)和全反射光路)2. 10us-10s 以上(磷光壽

4、命) 10ps-10us(熒光壽命)3. 波長范圍： 200-900nm (UV-VIS-NIR)4. 掃描速度： 150nm/s9靈敏度高：比紫外-可見分光光度法高24個(gè)數(shù)量級； 檢測下限：0.10.1 g/cm-3 相對靈敏度：0.05-0.005ppb（0.05M H2SO4)選擇性高重現(xiàn)性好取樣量少儀器不復(fù)雜 （三）熒光分析方法的特點(diǎn)、方法及應(yīng)用 1特點(diǎn) 102方法及應(yīng)用 檢測：金屬離子、有機(jī)物、生物分子生物分子相互作用研究疾病診斷 定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所發(fā)射的熒光波長不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度 呈線性關(guān)系。分析方法直接熒光法（能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的藥物

5、）間接熒光法（不能產(chǎn)生熒光或熒光很弱的藥物）11六、有機(jī)質(zhì)譜法1. 質(zhì)譜基本知識(shí)質(zhì)譜儀質(zhì)譜分析原理質(zhì)譜圖2. 離子峰的主要類型3. 有機(jī)質(zhì)譜中的裂解反應(yīng)4. 有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖12質(zhì)譜法將化合物分子在高真空條件下，用高能電子轟擊或強(qiáng)電場使其電離，電離產(chǎn)物按質(zhì)荷比(m/z)大小進(jìn)行分離記錄所得圖譜即所謂的質(zhì)譜圖?；?3高真空條件 10-4-10-6 Pa質(zhì)荷比 質(zhì)量/電荷 分離 聚焦電離 電場或高能電子轟擊(70ev,6,000KJ.mol-1) M e- M 2e- 14（1）質(zhì)譜計(jì) 質(zhì)譜計(jì)須有進(jìn)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測記錄系統(tǒng)。 為了獲得良好分析，必須避免離子和

6、氣體分子的碰撞，凡有樣品分子及離子存在和通過的地方，都處于真空狀態(tài)。進(jìn)樣系統(tǒng)電離系統(tǒng)質(zhì)量分析器檢測記錄系統(tǒng)1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場致電離 和場解吸4.快原子轟擊5.電噴霧電離 1.單聚焦 2.雙聚焦 高真空系統(tǒng)15電子轟擊 利用高速電子束撞擊氣態(tài)分子，將分解出的陽離子高速導(dǎo)入質(zhì)量分離器中，按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序收集，并以質(zhì)譜圖記錄下來，根據(jù)質(zhì)譜峰位置進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析，或根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。化學(xué)電離 高能電子束和小分子反應(yīng)氣體，甲烷等，反應(yīng)生成初級離子，CH4+.，再和樣品分子反應(yīng)，使之電離。強(qiáng)致電離 電場作用下，汽化樣品分子的電離16場解吸

7、不需要汽化，將樣品吸附在處理過的金屬尖端，通以微電流，金屬成為場離子發(fā)射體，使樣品解吸，離子化。快原子轟擊 高能原子束轟擊，采用基質(zhì)負(fù)載樣品，用于不穩(wěn)定的極性分子。電噴霧電離 樣品溶液在強(qiáng)靜電場作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，溶劑不斷揮發(fā)，液滴裂分，最終形成帶電離子，可用于分子量大于20000的生物分子和絡(luò)合物分析。17離子源重離子路徑離子收集器18離子源結(jié)構(gòu)19（2）質(zhì)譜分析原理 質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場中，其動(dòng)能與勢能相等，即 (1/2) m 2 = z U 質(zhì)量為m, 電荷為z的正電荷離子，經(jīng)外加電場U的加速，離子的運(yùn)動(dòng)速

8、度為。在磁場存在下，帶電離子按曲線軌跡飛行； 向心力= 離心力 ； Hz = m 2 / R20 質(zhì)譜方程式：m/z = (H2 R2) / 2U 離子在磁場中的軌道半徑R取決于： m/z 、 H 、 U向心力=離心力； Hz = m 2 / R固定U值，將H由小到大連續(xù)改變, 在狹縫收集的離子的m/z 比也由小到大地改變。21單聚焦質(zhì)譜計(jì)雙聚焦質(zhì)譜計(jì)22各種峰表示不同質(zhì)/荷比的離子；縱坐標(biāo)以相對豐度表示，峰越高表示形成的離子越多； （即譜圖中以最強(qiáng)峰高為100%，分別計(jì)算其他峰強(qiáng)度）（3）質(zhì)譜圖基峰：質(zhì)譜圖中離子強(qiáng)度最大的峰23六、有機(jī)質(zhì)譜法1. 質(zhì)譜基本知識(shí)2. 離子峰的主要類型分子離子峰

9、同位素離子峰碎片離子峰重排離子峰兩價(jià)離子峰3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)4. 有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖24（1）分子離子峰質(zhì)譜信號(hào)十分豐富。分子在離子源中可以產(chǎn)生各種電離，即同一種分子可以產(chǎn)生多種離子峰，其中比較主要的有分子離子峰、重排離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰等。 試樣分子在高能電子撞擊下失去一個(gè)價(jià)電子，即 M e- M 2e- 生成的離子稱為分子離子或母離子。其中“+”代表正離子，“.”代表不成對電子。 分子離子的質(zhì)量與化合物的分子量相等。25分子離子母離子奇電子離子碎片離子+.26質(zhì)譜圖上哪個(gè)是分子離子峰，哪個(gè)是基峰？思考！1305729871014127有機(jī)化合物分子離子峰的相

10、對強(qiáng)度：在質(zhì)譜中，分子離子峰的強(qiáng)度和化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。環(huán)狀化合物比較穩(wěn)定，不易碎裂，因而分子離子較強(qiáng)。支鏈較易碎裂，分子離子峰就弱，有些穩(wěn)定性差的化合物經(jīng)?？床坏椒肿与x子峰。芳香化合物共軛鏈烯烯烴脂環(huán)化合物直鏈烷烴酮胺酯醚酸支鏈烷烴醇28M=93律分子中若含有偶數(shù)個(gè)氮原子，則相對分子質(zhì)量將是偶數(shù)；反之，將是奇數(shù)。這就是所謂的“氮律”。29例如：CH4 M=1612C+1H4=16 M13C+1H4=17 M+112C+2H+1H3=17 M+113C+2H+1H3=18 M+2同位素峰分子離子峰（2）同位素離子峰（M+1峰）由于同位素的存在，可以看到比分子離子峰大一個(gè)質(zhì)量單位的峰；有時(shí)還可以觀

11、察到M+2，M+3.；1615m/zRA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z30（3）碎片離子峰 一般有機(jī)化合物的電離能為713電子伏特，質(zhì)譜中常用的電離電壓為70電子伏特，過剩的能量使分子離子化學(xué)鍵斷裂，產(chǎn)生各種“碎片”離子。31H3CH3CC=O+ CH3CH3 CO+ CO CH3+M+ = 58m/z = 43m/z = 15碎片可以來剖析分子的結(jié)構(gòu)32常見丟失碎片 常見穩(wěn)定離子33（4） 重排離子峰 當(dāng)分子中裂解為碎片離子時(shí)，在鍵斷鏈的同時(shí)，分子內(nèi)部的原子或基團(tuán)重排，形成隨片離子，這種離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為重排離子峰。34（5） 兩價(jià)離子峰 分子受轟

12、擊后，失去兩個(gè)電子，形成M2+離子， M2+離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為兩價(jià)離子峰。一些雜環(huán)、芳環(huán)和高度不飽和的化合物也易形成兩價(jià)離子峰，而決大多數(shù)藥物和毒物均有雜環(huán)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。 除上述離子峰外，還可能有亞穩(wěn)離子峰以及碎片與中性碎片反應(yīng)形成的離子峰等。對于一張未知化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析時(shí)，必須慎重、全面考慮。35六、有機(jī)質(zhì)譜法1. 質(zhì)譜基本知識(shí)2. 離子峰的主要類型3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)自由基引發(fā)的裂解反應(yīng)自由基引發(fā)的重排反應(yīng)4 有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖生物質(zhì)譜36裂解C-Y或C=Y（Y=O，N，S）基團(tuán)的化合物與這些基團(tuán)相連的化學(xué)鍵斷裂。自由基或電荷定位在分子中某個(gè)特定的位置上，然后以一

13、個(gè)電子或電子對的轉(zhuǎn)移來引發(fā)裂解反應(yīng)。C的價(jià)電子基本上都用于成鍵；O，N，S有非鍵電子（1）自由基的位置引發(fā)的裂解反應(yīng)37裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730裂解丟失最大烴基的可能性最大丟失最大烴基原則38麥?zhǔn)现嘏牛∕clafferty rearrangement)位的H 轉(zhuǎn)移到雜原子上，同時(shí) 鍵發(fā)生斷裂，生成一 個(gè)中性分子和一個(gè)自由基陽離子（2）自由基位置引發(fā)的重排反應(yīng)鍵斷裂的同時(shí)有氫原子發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生重排離子；39六、有機(jī)質(zhì)譜法1. 質(zhì)譜基本知識(shí)2. 離子峰的主要類型3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)4 有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖烴類化合物的裂解雜原子化合物的裂解常見質(zhì)譜圖40（1

14、） 烴類化合物的裂解優(yōu)先失去大的基團(tuán)，優(yōu)先生成穩(wěn)定的正碳離子。C6H5CH2+ CH2=CHCH2+ R3C+ R2CH+ RCH2+ CH3+穩(wěn)定性41 直鏈烷烴正癸烷M=14M-29CH3CH2CH2+ CH3CH+CH3異構(gòu)化生成穩(wěn)定的正碳離子42有m/z ：29，43，57，71，CnH2n+1 系列峰M=14M-29基峰為43或5743 支鏈烷烴CH3CH2CH2CH2 CH3C+（CH3）244 環(huán)烷烴環(huán)烷烴分子離子峰較強(qiáng)45 烯烴41基峰是烯丙基正離子， M=41CH2=CHCH2+46 芳香烴47M=14M-29基峰為43或57直鏈烷烴和支鏈烷烴質(zhì)譜圖有什么異同之處？支鏈烷烴有M-15環(huán)烷烴分子離子峰較強(qiáng)芳香烴 芐基正離子一般是基峰（91） 有苯環(huán)斷裂的特征峰77，65，37.烯烴的基峰一般是烯丙基正離子，M=41小 結(jié)48特征：m/z = 31+n*14 ; CH2=OH； 出現(xiàn)M-18峰, 失去一分子的水；+（2） 含雜原子化合物的裂解醇，酚，醚類的裂解49 M - 1850芐醇：M-1峰比較強(qiáng)；m/z=79峰比較特征.苯酚的質(zhì)譜與芐醇會(huì)有什么不同呢？基峰51苯酚 94的峰強(qiáng)，77的峰很弱。52（3） 常見質(zhì)譜圖 醚的質(zhì)譜圖53 醛、酮、酸的質(zhì)譜圖54 CH3CH2CH2COOH麥?zhǔn)现嘏?5麥?zhǔn)现嘏?6 其他化合物的質(zhì)譜圖578644重排5884H重排705