血管生成實(shí)驗(yàn)步驟

1、無(wú)論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長(zhǎng)直徑超過(guò)12 mm ,都會(huì)有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長(zhǎng)迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用，抑制這一過(guò)程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實(shí)驗(yàn)就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過(guò) 程，并且適合研究藥物對(duì)這一過(guò)程的影響實(shí)驗(yàn)。圖一血管生成鏡檢圖實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法1圖一血管生成鏡檢圖實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法1實(shí)驗(yàn)材料材料名稱材料名稱1細(xì)胞HUVEC (Pr&moCeLl, C-12200, C-12203)104 per w&ll2Endothelial Cell

2、G rowt h M e d i li m (Promo匚歸C-ZZOIQ)50 |_il per well3基質(zhì)膠BD Matrigel (Growth Factor RedLicedt 356231)10 pl per well4耗材血管生成載玻片T ibiTreat （品牌ibiidi, 81506；1 Slide5登疫茨光試剤Catcein AM (PtomoKine, PK-CA7O7-SO01 1 )1 ml 6.25 pg/ml)6其他細(xì)格紙1 sheet胰前(PromocelU C-41310)8 ml per T75 flask2實(shí)驗(yàn)方法：2.1實(shí)驗(yàn)流程介紹Storage-2

3、00iMiitrigielPo lyme riati o nTutje Formation Dlo AccjiLiisition12 - Nd hStorage-200iMiitrigielPo lyme riati o nTutje Formation Dlo AccjiLiisition12 - Nd h圖二實(shí)驗(yàn)流程圖（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液 加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹Coverstiotlomq Coverstiotlomq mm& nnm圖三血管生成載玻片縱截面示意圖（Matrig

4、el鋪在下孔，細(xì)胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹Data AcquisitionData Analysts6 - 24 h15 min*Data InterpretationPhase Contrast orFluorescenceImagesData AcquisitionData Analysts6 - 24 h15 min*Data InterpretationPhase Contrast orFluorescenceImagesAutomated ImageAnalysis(Wimasis)Statistical Tests of Stimulated

5、and Control D?ta圖四實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集和分析流程圖（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片,并且進(jìn)行圖像分析（Wimasis全自動(dòng)分析）測(cè)量小管長(zhǎng)度, 成環(huán)數(shù)，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。）（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片,一 實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠1實(shí)驗(yàn)前一天將 Matrigel置于冰盒中，放入 4。C冰箱，使膠能過(guò)夜緩慢融化。（注意: 同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取 Matrigel）2開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將 Matrigel始終保持放在冰盒中。3打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。4每孔中加入 10卩l(xiāng) Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Ma

6、trigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10卩l(xiāng)的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔一一這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel :我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。Insufficient Adequate Excessivevolumevolume volume如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了， 那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，

7、格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。凝膠1.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。2準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。 將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。Preparing the humidity chamborp-Slido plsceid in the hurnidity diaimbai*r3、鋪細(xì)胞加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種1

8、0000個(gè)細(xì)胞即可。1準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。2將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。3每孔加入50卩l(xiāng)的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠尅?同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上 孔液體正好加滿。5蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。Sin king process of celh. After $ome minutes all of the celk have fallen to the ground4、采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以按照細(xì)

9、胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像，并且對(duì)其成管長(zhǎng)度， 覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析Tlmai Lapse picturss with a lOuc nnagnification nt 6 2 and 4 hours.5、免疫熒光染色根據(jù)需要，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。加入 50卩l(xiāng)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 卩l(xiāng) calcein stock 1，使其終濃度 為 6.25 卩 g/ml (1:160)在室溫下避光孵育 30分鐘。使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。 使用485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。HUVEC network stained with emlcArn (6,25實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)1這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法能