酶學(xué)概論課件

1、二專一性 絕對專一性化學(xué)結(jié)構(gòu)專一性 族專一性 (基團(tuán)專一性) 相對專一性 鍵專一性 旋光異構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性 幾何異構(gòu)專一性三. 反應(yīng)條件 溫和，常溫常壓下進(jìn)行。四. 酶的活性是受調(diào)節(jié)控制的（一）通過影響酶蛋白的量影響酶的活性 1.代謝物 組成酶：細(xì)胞中含量較為穩(wěn)定，不受代謝物影響。 誘導(dǎo)酶：細(xì)胞接觸到誘導(dǎo)物后產(chǎn)生，誘導(dǎo)物往往是該 酶的底物或底物類似物。2. 同工酶： 能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu) 組成不同的一組酶。3.酶的降解 當(dāng)生物體已經(jīng)完成了某一發(fā)育過程，或者酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變而使其穩(wěn)定性下降，這些酶都會被降解。（二）通過改變酶分子的結(jié)構(gòu)或酶蛋白亞基之間的結(jié)合狀

2、態(tài)而影響酶的活性1. 別構(gòu)調(diào)節(jié)2. 激素調(diào)節(jié) 修飾亞基的水平是由激素控制的。妊娠時，修飾亞基在乳腺生成。分娩時，由于激素水平急劇的變化，修飾亞基大量合成，它和催化亞基結(jié)合，大量合成乳糖。如乳糖合酶催化亞基：催化反應(yīng)半乳糖+蛋白質(zhì)糖蛋白修飾亞基：與催化亞基結(jié)合后改變其專一性，催化UDP-galactose+D-glucose UDP+lactose3.共價修飾調(diào)節(jié) 比較普遍的方式是通過磷酸化與去磷酸化。最典型的例子是動物組織的糖原磷酸化酶，它催化如下反應(yīng)： （葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖 共價修飾調(diào)節(jié)：通過其它的酶對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行共價修飾，從而使其在活性形式和非活性形式之間相互轉(zhuǎn)

3、變。腎上腺素啟動肝細(xì)胞中由催化劑活化催化劑的反應(yīng)，最終引起細(xì)胞信號的放大。少量的腎上腺素與細(xì)胞表面的腎上腺素受體結(jié)合活化了腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP，繼而活化蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)，PKA再使無活性的磷酸化酶b激酶活化，磷酸化酶b激酶再使無活性的糖原磷酸化酶b活化為有活性的糖原磷酸化酶a，后者催化糖原分解。X代表作為起始信號的腎上腺素分子數(shù)，x前面的數(shù)字代表每步反應(yīng)所活化的分子數(shù)。MAPK活化的促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白激酶 TF轉(zhuǎn)錄因子 Ras, Rac小G蛋白蛋白質(zhì)（酶）的磷酸化與去磷酸化在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著主要作用。據(jù)估計(jì)，真核生物有1/3的蛋白質(zhì)都受到由蛋白激

4、酶(protein kinase)和磷酸酶(phosphatase)作用所介導(dǎo)的可逆磷酸化作用調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)磷酸化可以調(diào)節(jié)酶的活性，蛋白構(gòu)象，并影響蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及改變蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位以及穩(wěn)定性。From: Pesaresi P et al. (2011) Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1807: 887896 根據(jù)發(fā)生磷酸化的氨基酸殘基的種類不同，蛋白激酶可以分為絲氨酸/蘇氨酸激酶，酪氨酸激酶和組氨酸激酶。有的蛋白激酶具有雙重底物特異性。共價修飾酶除了磷酸化和脫磷酸化調(diào)節(jié)酶外，還有腺苷?；c脫腺苷酰化調(diào)節(jié)酶、尿苷酰

5、化與脫尿苷?；{(diào)節(jié)酶等類型。 4限制性蛋白水解作用與酶活性控制。如酶原激活。5抑制劑和激活劑的調(diào)節(jié)。6反饋調(diào)節(jié)：催化某物質(zhì)生成的第一步反應(yīng)的酶的活 性，往往被其終端產(chǎn)物所抑制。這種對自我合成的 抑制叫反饋抑制。 A-J：代謝物實(shí)線箭頭：酶促催化步驟虛線箭頭：反饋抑制步驟代謝途徑的第一步和共同底物進(jìn)入分支途徑的分支點(diǎn)是反饋抑制的最為重要的位點(diǎn)。7金屬離子和其它小分子化合物的調(diào)節(jié)。8蛋白質(zhì)剪接 一個單一的前體蛋白通過剪接機(jī)制可以產(chǎn)生多種蛋 白質(zhì)（酶）分子，從而具有不同的功能或活性。 蛋白質(zhì)剪接中，被切去的肽段稱為內(nèi)含肽(intein )， 連接起來形成成熟蛋白質(zhì)的肽段稱為外顯肽(extein)。

6、先前認(rèn)為蛋白質(zhì)剪接是由內(nèi)含肽所介導(dǎo)的，但現(xiàn)在否 認(rèn)了這一看法。因此對蛋白質(zhì)剪接的機(jī)制目前仍然是 不清楚的。 *酶活性的表現(xiàn)不僅需要一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而且是一個由基因決定的，受到多重調(diào)控的復(fù)雜過程。而其中酶的生物合成是一個關(guān)鍵，這一過程又受遺傳基因及代謝物的雙重控制。遺傳基因的存在是形成酶的內(nèi)在原因及根據(jù)。但是，酶的形成還受到代謝物（酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物或它們的類似物）的調(diào)節(jié)與控制，從而最終決定酶的生成數(shù)量及速度。 此外，酶的區(qū)室化(compartmentation)和多酶復(fù)合體 等都和酶活力的調(diào)節(jié)控制有密切聯(lián)系。第二節(jié) 酶的組成、分類和命名一酶的組成（一）根據(jù)酶的化學(xué)組成 單純酶 酶蛋白 結(jié)合酶

7、輔因子（二）根據(jù)酶蛋白的特點(diǎn)及分子大小 1單體酶：只有一條多肽鏈，分子質(zhì)量為1335 ku， 為數(shù)不多，且都是水解酶； 2寡聚酶：由若干相同或不同亞基非共價結(jié)合而組成的 酶，亞基一般無活性，必須相互結(jié)合才有活性，分子 質(zhì)量為35 ku以上到數(shù)百萬單位； 1）含相同亞基的寡聚酶。比較重要的有下面兩類a多催化部位（寡聚）酶：由相同亞基組成，每個亞基 上都有一個催化部位，但無調(diào)節(jié)部位。這類酶的游離 亞基無活性，必須聚合成寡聚酶才有活性；b可調(diào)節(jié)酶：主要是指別構(gòu)酶和共價調(diào)節(jié)酶。 2）含不同亞基的寡聚酶： *寡聚酶中亞基的聚合作用，有的與酶的專一性有關(guān)， 有的與酶活性中心的形成有關(guān)，有的與酶的調(diào)節(jié)性能

8、有關(guān)。大多數(shù)寡聚酶，其聚合形式是活性型，解聚形 式是失活型。3多酶復(fù)合體（multienzyme complex）：多種酶進(jìn)行 連續(xù)反應(yīng)的體系。4多酶融合體 (multienzyme conjugate) (雜合酶) 一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，它 往往是基因融合的產(chǎn)物。二酶的命名1推薦名：以習(xí)慣名為基礎(chǔ) （酶的來源或性質(zhì)）+底物名稱+催化反應(yīng)的類型 （水解反應(yīng)可省去“水解”二字） 特點(diǎn)：比較簡單，便于使用。2系統(tǒng)名 酶的作用底物（底物之間用“：”隔開）+酶作用的基 團(tuán)+催化反應(yīng)的類型 特點(diǎn)：嚴(yán)格，但更為詳細(xì)準(zhǔn)確地反映出酶所催化的反 應(yīng)。 如： COO- CH3 COO- CH

9、3 | | | | (CH2)2 + C=O (CH2)2 + C-N+H3 | HC-N+H3 COO- C=O COO- | | COO- COO- 推薦名：谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名：谷氨酸：丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶 三國際系統(tǒng)分類法及編號 六大蛋白類酶 氧化還原類酶AH2+BA+BH2 轉(zhuǎn)移酶AB+CA+BC 水解酶ABH2OAOH+BH 裂合酶ABA+B 異構(gòu)酶 連接酶或合成酶A+B+ATPABADP+Pi（或AB AMP+PPi） 兩個比較容易混淆的酶1）氧化磷酸化與光合磷酸化中，以跨膜質(zhì)子動力勢為動力推動ATP形成的酶是ATP合成酶還是ATP合酶？ 催化的反應(yīng)：ADP+PiATP 合成酶：syn

10、thetase; 合酶：synthase2）DNA (RNA)聚合酶屬于六大類酶中的什么類型？ 催化的反應(yīng)：dATP+DNA DNA-dAMP+PPiDNA聚合酶Mg2+第三節(jié) 酶的活力測定 一酶活力：在一定條件下，酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速 度，它可以用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的 增加量表示。 二酶活力測定方法 注意事項(xiàng)： 1底物及底物濃度的選擇 a.根據(jù)其專一性選擇底物； b.一般采用高底物濃度測定法(10-20 Km)。 2反應(yīng)條件的選擇 a.一般應(yīng)采用酶的最適反應(yīng)條件，確保反應(yīng)條件在整個 反應(yīng)過程中盡量保持不變； b.如需要激活劑，取其最適濃度，且維持恒定。還要保 證不存在該酶的抑制劑。

11、 3選擇合適的化學(xué)反應(yīng)及檢測指標(biāo) a.如酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物具光吸收、旋光、電位差改 變或熒光的變化等性質(zhì)，可以直接檢測；260 nm340 nm很多脫氫酶以NAD(P)為輔酶，可以測定反應(yīng)前后340 nm光吸收的變化。 如：己糖激酶 葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡萄糖-6-磷酸+NADP 6-磷酸葡萄糖酸+ NADPH+H+ c.一般以測定產(chǎn)物在反應(yīng)初期的生成速度為好。b.對于一些不能直接測定底物或產(chǎn)物的酶反應(yīng)，可通過 與其它可檢測產(chǎn)物的酶反應(yīng)偶聯(lián)，使第一個酶反應(yīng)的 產(chǎn)物變?yōu)榈诙€酶反應(yīng)的底物。 三酶的活力單位：1國際單位（IU）：在特定條件下（溫度可采用25 或

12、其他選用的溫度，pH值等條件均采用最適條件）， 每分鐘催化1 mol底物轉(zhuǎn)化的酶量。2比活力：在特定條件下，每毫克(mg)酶蛋白所具有的 酶活力單位數(shù)，即：酶比活力=酶活力（單位）/mg蛋 白。它是酶純度的一個指標(biāo)。四酶的轉(zhuǎn)換數(shù)與催化周期1酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：又稱為摩爾催化活性（molar catalytic activity），是指每個酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的 分子數(shù)。即每摩爾（或微摩爾）酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn) 變?yōu)楫a(chǎn)物的摩爾（或微摩爾）數(shù)，是酶催化效率的一 個指標(biāo)。通常用每微摩爾酶的酶活力單位數(shù)表示，單 位為min-1。2.酶的催化周期： 是指酶進(jìn)行一次催化所需的時間，單位為毫秒或微 秒。在數(shù)值上等

13、于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)。第四節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與功能一級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)功能表現(xiàn) （有時與輔因子一起）一酶分子中的氨基酸殘基對酶促反應(yīng)的不同貢獻(xiàn) 與底物結(jié)合、催化作用接觸殘基 活性中心催化活性顯示作用 協(xié)助催化作用 輔助殘基 活性中心外（維持空間構(gòu)象作用）結(jié)構(gòu)殘基其它方面作用(活性調(diào)節(jié)、防止降解、運(yùn)輸轉(zhuǎn)移等） 非貢獻(xiàn)殘基接觸殘基:R1, R2, R6, R8, R9, R163, R164, R165輔助殘基: R7結(jié)構(gòu)殘基: R10, R162, R169 非貢獻(xiàn)殘基:R3, R4, R5二酶的活性部位（中心）1概念：酶分子中，顯示酶的催化活性的特殊部位稱為活性部位。酶aa殘基數(shù)活性部位的aa殘基RNas

14、e ALysozymeChymotrypsinPepsinPapainCarboxypeptidase A124129241348212307His12, His119, Lys41Asp52, Glu35His57, Asp102, Ser195Asp32, Asp215Cys25, His159Arg127, Glu270,Tyr248, Zn2+某些酶活性部位的AA殘基胰凝乳蛋白酶活性部位與底物的結(jié)合紅色表示底物，酶分子表面的紅色區(qū)域表示酶分子關(guān)鍵的活性部位氨基酸殘基。紅色的線條代表底物。酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始階段）黑體部分酶的活性中心2結(jié)構(gòu)組成： 底物結(jié)合部位：參與酶與底物

15、的結(jié)合和使底物處于被 催化的正確位置酶的專一性 催化部位酶催化反應(yīng)的性質(zhì) *底物結(jié)合部位與催化部位并不是絕對的，活性中心的 某些基團(tuán)同時兼有這兩種功能。3酶的活性中心的構(gòu)成：不需要輔酶的酶：三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或是這些殘基上的某些基團(tuán)。需要輔酶的酶：輔酶分子，或者輔酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)，以及與輔酶緊密偶聯(lián)的蛋白區(qū)域。酶接觸殘基絲氨酸附近的氨基酸順序胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶A（牛）彈性蛋白酶凝血酶Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Pro-Val-Cys-Ser-GlySer-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Pro-Leu-

16、Val-Cys-LysSer-Gly-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-LeuAsp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys4酶分子活性中心的進(jìn)化：一些絲氨酸蛋白酶接觸殘基絲氨酸附近的氨基酸順序酶活性中心在種系進(jìn)化上存在嚴(yán)格的保守性。5酶活性基團(tuán)的鑒定： .物理法：X-射線衍射（晶體）、核磁共振（溶液）等 物理方法，直接 X-射線衍射：蛋白質(zhì)的晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測定 的周期較長。 核磁共振：對樣品的需要量大，純度要求高，被測蛋 白質(zhì)的分子量一般不超過20 000。 .化學(xué)法 基本思路

17、化學(xué)修飾劑修飾特定殘基測定酶活的變化確定該 殘基在酶催化反應(yīng)中的作用。 a.共價修飾 測酶活 酶+共價修飾劑 復(fù)合物水解分離出含共價修飾物的 肽段分析該肽段序列 不 失 活 非活性中心 完全失活 活性中心 部分失活 活性中心，但可能只是其底物結(jié)合部 位，而非催化部位，或?yàn)榛钚灾行囊?外的必需基團(tuán)。 b.親和標(biāo)記 酶+與底物結(jié)構(gòu)相似的修飾劑復(fù)合物水解分離出 含修飾劑的肽段分析肽段序列確定活性中心 c.差別標(biāo)記 酶+過量底物+修飾劑不被修飾 酶+帶標(biāo)記的同種修飾劑復(fù)合物水解分離帶標(biāo)記 的肽段分析肽段序列確定活性中心.定點(diǎn)突變方法 8種在酶的活性中心中出現(xiàn)頻率最高的的氨基酸殘基 Ser, His, Cys, Tyr, Trp, Asp, Glu, Lys三別構(gòu)酶結(jié)構(gòu)及活性調(diào)節(jié)： 活性中心：與配體（底物）結(jié)合并催化轉(zhuǎn)化底物 別構(gòu)部位：與別構(gòu)配體（效應(yīng)物）結(jié)合酶分子構(gòu)象 改變活性中心構(gòu)象改變影響酶