第2節(jié)基因工程的基本操作程序課件

1、第2節(jié)基因工程的基本操作程序第2節(jié)基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用 載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。 才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達?；蚬こ袒静僮鞯乃膫€步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質的基因：如：與生物抗性相關的基因、與優(yōu)良品質相關的基因、與生物藥物和保健品相關

2、的基因、與毒物降解相關的基因、與工業(yè)用酶相關的基因、具調控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質的基因：2獲取目1. 從基因文庫中獲取目的基因1. 基因文庫的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。2. 基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫3.基因文庫的目的：為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。1. 從基因文庫中獲取目的基因1. 基因文庫

3、的概念:將含有某基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內全部DNA 許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導入基因組文庫cDNA反轉錄受體菌群體與運載體連接導入cDNA文庫某種生物某個時期的mRNA基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內全部DNA 許多DN基因的結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結合位點外顯子內含子終止子啟動子原核真核基因的結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結合位點外顯子內原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子不編碼蛋白質。：編碼蛋白質 ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)調控遺傳信息表達,上 游的RNA聚合酶結合

4、位點:基因結構原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內含子 外顯子 啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用,上游有RNA聚合 酶結合位點(啟動子)。與RNA聚合酶結合位點基因結構真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內含子 外顯子 啟動原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_的編碼區(qū)是間隔的、_的相同點都由能夠編碼蛋白質的_和具有調控作用的_區(qū)組成的編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非

5、編碼思考原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)基因文庫的構建方法 基因組文庫的構建提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導入受體菌中儲存基因文庫的構建方法 基因組文庫的構建提取某種生物的全部DN cDNA文庫的構建-逆轉錄法： 提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存 cDNA文庫的構建-逆轉錄法： 提取某種生物的某思考？真核生物的基因用逆轉錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？思考？真核生物的基因用逆轉錄法得到的

6、真核細胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNA雙鏈DNA逆轉錄酶轉錄剪接逆轉錄復制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內含子真核細胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫 文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段） 基因多少 物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 文庫類型 2.利用PCR技術擴增目

7、的基因1概念：PCR全稱為_，是一項 在生物_復制_的核酸合成技術。 2原理：DNA復制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技術擴增目的基因1概念：2原理：DNA復制多聚第2節(jié)基因工程的基本操作程序PCR技術的操作過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_b、退火（復性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復a.b.c步驟：每重復一

8、次，目的基因增加_倍一PCR技術的操作過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DPCR技術的操作過程PCR技術的操作過程PCR技術的操作過程PCR反應體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增PCR技術的操作過程PCR反應體系中目的基因成指數(shù)(2n)形PCR技術擴增與DNA復制的比較DNA復制PCR技術場所原理條件解旋方式酶特點結果堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復制、邊解旋邊復制半保留復制、全解旋再復制體外復制主要在細胞核內大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶

9、、解旋酶等PCR技術擴增與DNA復制的比較DNA復制PCR技術場所原理3. 人工合成法 在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學合成推測推測思考：化學法合成的目的基因含內含子、啟動子和終止子嗎？3. 人工合成法 在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利人工合成法（真核生物）反轉錄法目的基因的信使RNA目的基因化學合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測推測單鏈DNA合成人工合成法（真核生物）反轉錄法目的基因的信使RNA目的基因化課堂小結目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用

10、PCR技術擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫課堂小結目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術二、基因表達載體的構建 基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因二、基因表達載體的構建 基因工程的核心1目的：2基因表達表達載體啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的

11、一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來表達載體啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是R基因表達載體的構建過程質粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種一個切口兩個黏性末端基因表達載體的構建過程質粒DNA分子限制酶處理兩個切口DNA注意：載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵

12、都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意：載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部 三、將目的基因導入受體細胞1轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。2常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。3目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。 三、將目的基因導入受體細胞1轉化：2常用的受體細胞：3目的1、目的基因導入植物細胞的方法（1）農桿菌轉化法 農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植 物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。 原理：Ti質粒

13、上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。1、目的基因導入植物細胞的方法（1）農桿菌轉化法 農桿三、目的基因導入受體細胞構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表達過程：三、目的基因導入受體細胞構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導1、目的基因導入植物細胞的方法（2）基因槍法：目的基因導入單子葉植物細胞 操作方法：利用壓縮氣體產生的動力 ，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。 鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um 。 適用：單子葉植物1、目的基因導入植物細胞的方法（2）基因槍法：目的基因導入單1、目的基因

14、導入植物細胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞 特點:十分簡便經濟。 例：轉基因抗蟲棉1、目的基因導入植物細胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因2、將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法程序目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物2、將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法程序目的基因表3、將目的基因導入微生物細胞微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞過程：C

15、a2+處理大腸桿菌感受態(tài) 細胞感受態(tài)細胞 吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合3、將目的基因導入微生物細胞微生物作受體細胞原因：Ca2+小結：將目的基因導入受體細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射技術Ca2+處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的DNA表達將含有目的基因的表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞重組表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子小結：將目的基因導入受體細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細 四、目的基因的檢測與

16、鑒定導入過程完成后，全部受體細胞都能攝 入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？ 不一定，需要檢測 四、目的基因的檢測與鑒定導入過程完成后，全部受體細胞都能攝1、鑒定分子水平的鑒定轉基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法DNA分子雜交技術變性變性1、鑒定分子水平的鑒定轉基因生探針15N15N14N141、鑒定分子水平的鑒定變性方法分子雜交技術（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA探針15N15N轉基因生物的mRNA14N

17、14N1、鑒定分子水平的鑒定變性方法分子雜交技術（2）檢測1、鑒定分子水平的鑒定提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質 出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、鑒定分子水平的鑒定提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋2、鑒定個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2、鑒定個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗思考？不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，

18、才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？思考？不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完課堂練習1、有關基因工程的敘述中，錯誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、限制性內切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、人工合成目的基因不用限制性內切酶A課堂練習1、有關基因工程的敘述中，錯誤的是( )A課堂練習2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細胞中提取 利用PCR技術 利用DNA轉錄 人工合成 A. B. C. D.D課堂練習2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )D課堂練習3、有關基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質粒的形成在細胞內完成 C、質粒都可作為運載體 D、蛋白質的結構可為合