放射免疫-熒光標記免疫課件

1、 現(xiàn)代免疫分析技術-放射免疫與熒光免疫免疫分析技術的發(fā)展多元免疫技術免疫沉淀免疫凝集補體結合反應中和反應免疫標記技術經典免疫學方法化學發(fā)光膠體金酶免疫免疫熒光放射免疫PCR-免疫分析時間分辨熒光分析免疫標記技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏度特異性免疫標記技術的主要特點：高特異性、高靈敏度免疫技術+標記技術檢測方法 檢測范圍生化、常規(guī)免疫 mgg（10-3 10-6 g）熒光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、發(fā)光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）標記技術：將可被探測的示蹤物質用化學方法與化合物連接。免疫技術：以抗原-抗體

2、反應原理為基礎，對樣品中相應抗原或抗體進行檢測。標記免疫分析：是利用多種標記技術與免疫技術相結合而建立的測定技術體系。其核心即是高靈敏性和高度特異性的有機結合。標記免疫技術基本概念放射免疫技術1959年，美國，Yalow和Berson測定血清胰島素含量（標記抗原）1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎 放射免疫分析技術（Radioimmunoassay，RIA） 優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，結果準確，檢樣用量少，結果重復性好，操作易自動化；缺點：對抗體質量要求高，有放射性危害，檢測儀器價格較高 Ag Ab *Ag Ag-Ab+標記抗原（F） 特異性抗體 被檢抗原 非標記抗原抗體復合物標記抗原抗體復合物（B）

3、*Ag-Ablimited, competitive 1.1 放射免疫分析（RIA）技術原理抗原標準品與待測抗原 結構-完全相同/結構相似且親和力相近 純度-純度90%以上（免疫純） 較高的放射比放射性同位素特異性抗體 特異性高、親和力高（Ka）、效價高 ?！叭摺?！ 1.2 放射免疫技術基本條件標記核素125I 3H 射線 理化性活潑 差核素豐度 90% 半衰期 60.2d 12.3y標記方法 簡單復雜標記設備 低廉( 計數(shù)儀)昂貴( 液閃儀)測量條件 簡單 復雜125I -標記物的鑒定比放射性：單位化學量標記物中所含的放射性強度;免疫活性：與過量抗體反應的百分比越大，標記物免疫活性越好 游

4、離抗原與免疫復合物的分離第二抗體沉淀法 PEG 沉淀法 PR 試劑法 活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響 操作應簡單、重復性好經濟 Ag* Ab Ag 標記抗原 特異性抗體 待測抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標準曲線上讀知含量 測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性 放射免疫測定法(RIA)示意圖 1.3 放射免疫技術基本類型液相法 平衡法（一步法） 順序加樣法 固相法免疫放射分析技術（immunoradiometric assay，IRMA）1968年，Miles 和Hales應用同位素標記胰島素

5、抗體，成功檢測牛血清中的胰島素。Type IRMARIA被標記物質抗體抗原抗體用量過量限量被檢抗原相對分子量相對較大相對較小反應方式分步結合競爭結合B、F分離方法固相洗滌分離液相沉淀/吸附分離2.1 免疫放射技術基本條件標記抗體的制備 抗體親和力要求不高固相抗原免疫吸附劑 對抗原吸附力強，對非特異性蛋白吸附少，結合過程中高度分散 （重氮化纖維素，瓊脂糖4B珠）2.2 免疫放射技術基本類型 經典IRMA） 雙抗夾心法2.2 免疫放射技術基本類型熒光免疫技術Immunofluorescence technique， IFAIntroduction:1958年，Riggs等合成了異硫氰酸熒光黃（fl

6、uorescent isothiocyanate，F(xiàn)ITC）；Marshall對熒光標記方法進行了改進，熒光技術逐漸推廣1942年，Coons等，異硫氰酸熒光素標記抗體，檢測小鼠組織切片中可溶性肺炎鏈球菌多糖抗原IFA熒光素敏感可測抗原抗體反應特異性顯微技術高度精確優(yōu)點：特異性強，敏感性高，速度快，結果直觀-病原微生物缺點：熒光標本保存難（淬滅）非特異性染色 熒光免疫分析（IFA）技術原理YYY 一種有機或無機化學物質，其接受激發(fā)光后，能夠以發(fā)射光形式產生明亮的熒光而作為染料使用。 各種熒光素都有各自的激發(fā)波長和發(fā)射波長。因發(fā) 射波長不同而顏色不同。 異硫氰酸熒光黃（FITC），四乙基羅丹明（

7、Rb200），藻紅蛋白（PE）。 熒光免疫分析（IFA）基本條件 1. 熒光素較高較穩(wěn)定的熒光效率具有能與蛋白質分子形成穩(wěn)定共價鍵的化學基團與蛋白質結合簡單快速結合產物的熒光顏色與實驗對象的自發(fā)熒光對比鮮明結合物具有一定的耐貯藏性 標記用熒光素應具備的條件抗體：特異性強、效價高、標記后活性高標記前：梅花狀雙擴測效價標記抗體種類：多克隆抗體、單克隆抗體、葡萄球菌A蛋白（熒光二抗通用試劑） 2. 待標記抗體1mg/mL FITC（ 異硫氰酸熒光黃）標記抗體Marsshall法原理 當FITC在堿性溶液中與抗體反應時，主要是抗體分子上的賴氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結合，一個IgG分子中有86個賴

8、氨酸殘基，一般最多能結合1520個。 3. 熒光標記抗體制備與純化熒光素- FITC- NC N - 蛋白質 FITC- N C N - 蛋白質 S H H H S H 操作流程抗體的準備：20mg/ml(抗體+生理鹽水+碳酸鹽緩沖液） 碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC （抗體與熒光素比例為50-100:1）標記：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h，4透析：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0緩沖鹽水透析過夜，0-4過柱：葡萄糖凝膠G50或 G25柱分離游離熒光素保存

9、：4 -40等量甘油分裝保存。 3. 熒光標記抗體制備與純化 4. 熒光標記抗體鑒定1 特異性染色效價測定-與相應抗原標本染色2 非特異性染色測定-與相類似抗原標本染色3 吸收試驗-在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應抗原陽性 標本染色，結果無明顯陽性熒光。4 F/P比值的測定方法F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質量， F/P=1-2， 過高-非特異染色增強； 過低-熒光很弱，降低敏感性。 經典熒光抗體染色法流式細胞儀（Flow Cytometor, FCM），以熒光免疫技術為基礎發(fā)展起來的專門的細胞分析技術。是一項集液流噴射技術、激光技術、電子物理技術、光

10、電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的檢測儀器。 現(xiàn)代免疫熒光技術 1. 流式細胞技術1. 流動室及液流驅動系統(tǒng)2. 激光光源及光束形成系統(tǒng)3. 光學系統(tǒng)4. 信號檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)5. 細胞分選系統(tǒng) 流式細胞儀工作原理熒光染色的細胞（微粒）懸液標本High Pressure流動室及液流驅動系統(tǒng)若干組透鏡、濾光片、小孔 -將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器 單細胞分析：任何單細胞懸液，如血液、骨髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞，實體組織經處理后制成單細胞懸液。快速分析：極短時間內可分析大量細胞，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千

11、個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。 流式細胞技術應用多參數(shù)分析：可同時分析單個細胞的多種特征,當同時用多種分子探針,如用不同熒光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色,通過流式細胞分析,即可獲得單細胞的多種信息,使細胞亞群的識別、計數(shù)等更為準確。定性或定量分析：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、Ca2+濃度等均可進行單細胞水平的定性與定量分析。 流式細胞技術應用1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini和Hemmila首次建立稀土離子標記物的“時間分辨熒光免疫技術分析”理論；1984年，Hemmila確定了DELFIA免疫熒光技

12、術方案，從而使DELFIA成為Wallac的專利技術。1989年該技術獲諾貝爾化學獎提名。90年代以來，時間分辨熒光技術因其靈敏度高，操作簡便，標準曲線范圍寬，不受樣品自然熒光干擾，無放射性污染等特點，其方法學研究和臨床應用的發(fā)展十分迅速。目前，時間分辨免疫熒光技術正成為現(xiàn)代醫(yī)學研究中最有發(fā)展的研究手段之一。 2. 時間分辨免疫熒光技術 Time-resolveduoroimmunoassa（TrFIA）示蹤劑：三價稀土離子包括有銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy）等。雙功能基團螯合劑：示蹤劑通過具有雙功能基團螯合劑與抗體（或抗原）以共軛雙鍵結合成標記物。稀土離子螯合物熒光光譜特點：1）特異性強

13、；2）Stokes位移大；3）熒光壽命長解離-增強技術：螯合劑在中性條件下與鑭系離子形成穩(wěn)定的螯合物，而在增強液（酸性）作用下，鑭系離子迅速被徹底釋放并與增強液中的配體螯合，使其熒光得以成千萬倍地放大。TrFIA的原理通過延續(xù)時間，使特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使理論本底達到0。發(fā)射光譜與激發(fā)光譜之間存在很大的Stokes 位移。通過干涉濾光片可將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。技術特點檢驗先進性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、特異性高靈敏度高解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍寬高靈敏度原子標記標記位點多，可達20個，對標記物結構及活性影響