H2O2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞AQP1和AQP5表達(dá)影響及其機(jī)制

1、PAGE PAGE - 10 -H2O2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞AQP1和AQP5表達(dá)影響及其機(jī)制李璐彭旭東林靜趙桂秋摘要目的探究氧化應(yīng)激對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞（HLECs）水通道蛋白（AQPs）表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法取健康人群和白內(nèi)障病人的晶狀體前囊膜，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)兩組AQP1和AQP5表達(dá)與分布情況。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度的H2O2作用HLECs不同時(shí)間后AQP1和AQP5mRNA表達(dá)情況;用400mol/L的H2O2刺激HLECs不同時(shí)間，Westernblot方法檢測(cè)AQP1和AQP5蛋白表達(dá)，RT-PCR和Westernblot分別

2、檢測(cè)絲裂酶原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制劑聯(lián)合H2O2（400mol/L）共同作用于HLECs后AQP1和AQP5的mRNA與蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果白內(nèi)障組晶狀體前囊膜中AQP1和AQP5的mRNA表達(dá)與分布明顯低于健康組（t=10.71、5.46，P0.05）.ConclusionOxidativestressreducestheexpressionofAQP1andAQP5inHLECs.Underoxidativestress，theMAPKpathways（p38andERK）areinvolvedintheregulationofAQP1expression，butnotinther

3、egulationofAQP5expression.KEYWORDSlens，crystalline;epithelialcells;aquaporins;mitogen-activatedproteinkinases;hydrogenperoxide目前，由于人口老齡化程度不斷加劇，在成年白內(nèi)障病人中年齡相關(guān)性白內(nèi)障（ARC）明顯多于其他類型，氧化損傷在該類型白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用1。隨著年齡的增長(zhǎng)，晶狀體內(nèi)抗氧化物質(zhì)逐漸降低，從而導(dǎo)致氧化物積聚在晶狀體中2，氧化物的積累使核DNA和蛋白質(zhì)遭到破壞，從而導(dǎo)致晶狀體混濁3。氧化應(yīng)激可以使絲裂酶原激活的蛋白激酶（MAPK）通路中的c-

4、JunN末端激酶（JNK）、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）蛋白磷酸化，參與組織氧化損傷的病理過程4。水通道蛋白（AQPs）的作用是通過調(diào)節(jié)溶質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，使晶狀體內(nèi)外的滲透壓達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，以維持晶狀體的穩(wěn)態(tài)與透明性5。本研究探討H2O2的氧化作用對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞（HLECs）AQP1和AQP5表達(dá)的影響，以及MAPK（JNK、p38、ERK）信號(hào)通路是否參與調(diào)控該條件下AQP1和AQP5表達(dá)的變化。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料人晶狀體囊膜取自青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的健康供體和白內(nèi)障病人。白內(nèi)障組晶狀體前囊膜由白內(nèi)障超聲乳化過程中環(huán)形撕取前囊膜獲得，正常組晶狀體前囊

5、膜從我院低溫醫(yī)學(xué)科提供的供體眼球獲得。將晶狀體前囊膜放入-80冰箱保存。HLECs（廣州JennioBiotech公司）;胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclone公司）;青霉素G、DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）;硫酸鏈霉素、蛋白裂解緩沖液（RIPAPMSF=10001）、EDTA液（北京So-labio公司）;JNK抑制劑（SP600125）、p38抑制劑（SB203580）、ERK抑制劑（U0126）（美國(guó)Selleckchem公司）;RNAisoPlus（購(gòu)自大連TaKaRa公司）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（購(gòu)自武漢Elabscience公司）;PrimeScriptRTreagentK

6、itWithgDNAEraser試劑盒（購(gòu)自南京Vazyme公司）;RM2025切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）;DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;光學(xué)顯微鏡（日本OlympusIXSO公司）。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1HLECs培養(yǎng)將HLECs接種于含有體積分?jǐn)?shù)0.10青霉素G（濃度0.1g/L）和硫酸鏈霉素（0.1g/L）的DMEM培養(yǎng)液中，置于37、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2、90%濕度環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，加入2.5g/L胰蛋白酶-EDTA液2mL，調(diào)整HLECs密度為11011/L的細(xì)胞懸浮液，接種到12孔或6孔組織培養(yǎng)板上，待細(xì)胞達(dá)到80%融合且生長(zhǎng)均勻時(shí)換成不含血清

7、的DMEM培養(yǎng)液。1.2.2HLECs分組及處理將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、H2O2刺激組和MAPK抑制劑組?？瞻讓?duì)照組不做任何處理。H2O2刺激組分別加入100、200、400和800mol/L的H2O2，分別培養(yǎng)1、2、4和6h收集細(xì)胞用于RT-PCR檢測(cè);H2O2刺激組每孔加入400mol/L的H2O2，分別培養(yǎng)4、8、16、24h收集細(xì)胞用于Westernblot檢測(cè)。抑制劑組分別加入JNK抑制劑（2.510-5mol/L）、p38抑制劑（110-5mol/L）、ERK抑制劑（210-5mol/L）預(yù)處理1h后再加400mol/L的H2O2，刺激4h后收集細(xì)胞用于RT-PCR檢測(cè)，刺激2

8、4h后收集細(xì)胞用于Westernblot檢測(cè)。1.2.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞AQP1和AQP5分布情況晶狀體前囊膜經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明、浸潤(rùn)和包埋處理以后，使用RM2025切片機(jī)行4m厚切片，然后脫蠟和水合，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。應(yīng)用檸檬酸緩沖液（pH值6.0）高壓修復(fù)抗原2min后再用PBS洗片3次。37下與兔抗人AQP1和小鼠抗人AQP5一抗（1200稀釋，美國(guó)Abcam公司）反應(yīng)2h，洗片后再與聚過氧化物酶羊抗兔/小鼠IgG二抗（上海Beyotime公司）反應(yīng)30min。用DAB試劑盒處理切片，光學(xué)顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒立即用蒸餾水沖洗，然后用

9、蘇木精復(fù)染1min，脫水，中性香脂封片后光鏡下觀察并拍片。用Image-proplus軟件分析AQP1和AQP5分布。1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)AQP1和AQP5的mRNA表達(dá)用RNAisoPlus提取晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞和各組HLECs總RNA，按PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用RT-PCR儀獲得循環(huán)數(shù)，計(jì)算AQP1和AQP5的mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物及其序列由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)與合成。見表1。1.2.5Westernblot檢測(cè)AQP1和AQP5蛋白表達(dá)

10、用蛋白裂解緩沖液收集各組HLECs細(xì)胞蛋白6，4、12000r/min離心10min，取上清液。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度2期李璐，等.H2O2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞AQP1和AQP5表達(dá)影響及其機(jī)制175并計(jì)算上樣量，經(jīng)蛋白煮沸變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、PBST漂洗后，用封閉液進(jìn)行2h封閉，之后加入一抗稀釋液-actin（12000）、AQP1（11000）、AQP5（11000）（美國(guó)Abcam公司）4孵育16h。PBST搖洗3次后加入二抗（山羊抗兔二抗15000、山羊抗鼠二抗1500）（美國(guó)Millipore公司）室溫孵育2h。再次用PBST搖洗3次后使用UVP凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍

11、照，用ImageJ軟件定量分析條帶的灰度值，以其表示蛋白的表達(dá)量。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以xs表示，兩組數(shù)據(jù)比較使用LSD-t檢驗(yàn);多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析（one-wayANOVA）或析因設(shè)計(jì)的方差分析。以P0.05）。與單純H2O2處理組相比，ERK、p38和JNK抑制劑預(yù)處理組AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見表6。3討論白內(nèi)障是一種由于晶狀體混濁而影響視覺功能的疾病，主要是由與年齡有關(guān)的晶狀體變性引起的7-8。目前，治療白內(nèi)障最有效的方式是通過手術(shù)摘除混濁晶狀體并植入人工晶體（IOL）9。但是，手術(shù)相關(guān)的并

12、發(fā)癥依然給病人視力的恢復(fù)帶來極大的挑戰(zhàn)10。因此，有必要對(duì)白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期獲得并發(fā)癥較少的治療方式。目前學(xué)術(shù)界一致認(rèn)為，白內(nèi)障的形成主要是由氧化損傷所導(dǎo)致11。構(gòu)成晶狀體蛋白的一些氨基酸對(duì)氧化損傷特別敏感，如半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸等，它們的結(jié)構(gòu)變化皆可引起蛋白質(zhì)的變性，造成晶狀體混濁12。導(dǎo)致體內(nèi)氧化損傷的主要因素是活性氧（ROS），而H2O2是細(xì)胞中含量最豐富、最穩(wěn)定的ROS13。AQPs介導(dǎo)水在細(xì)胞膜上的被動(dòng)運(yùn)輸，并參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)14。既往研究結(jié)果結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物HLECs中表達(dá)的AQPs包括AQP0、AQP1和AQP515，與白內(nèi)障密切相關(guān)16。有研究表明，

13、敲除小鼠HLECsAQP1和AQP5雖然晶狀體形態(tài)和透明性沒有改變，但其水滲透性比正常小鼠晶狀體明顯降低，并且在高糖溶液中更容易渾濁17-18。為研究白內(nèi)障病人晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中AQP1和AQP5的表達(dá)變化，本文收集了白內(nèi)障病人和健康供體的晶狀體前囊膜，應(yīng)用RT-PCR和免疫組化方法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示白內(nèi)障組AQP1和AQP5的mRNA表達(dá)明顯低于正常組，白內(nèi)障組晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞的數(shù)量較正常組明顯減少且排列不規(guī)則，AQP1和AQP5的分布明顯低于正常組。說明AQP1和AQP5的表達(dá)下降與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。既往有研究證實(shí)，在高氧肺損傷新生小鼠的肺組織中AQP1和AQP5蛋白表達(dá)較

14、對(duì)照組明顯降低19。為了探討氧化損傷對(duì)HLECsAQPs表達(dá)的影響，本研究體外培養(yǎng)了HLECs，并用H2O2處理模擬了氧化損傷，結(jié)果顯示，H2O2的濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，AQP1和AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降越明顯;H2O2濃度為400mol/L時(shí)作用最為明顯，分別在作用4h和24h時(shí)AQP1、AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平降至最低。目前，關(guān)于氧化損傷引起HLECs的AQP1和AQP5表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路參與視網(wǎng)膜氧化損傷過程中AQP1表達(dá)的調(diào)控20。但是，對(duì)于AQP5在晶狀體氧化損傷過程中表達(dá)變化及其具體機(jī)制目前尚未見報(bào)道。MAPK是一組能夠被多

15、種細(xì)胞外刺激物激活、參與調(diào)控細(xì)胞炎癥和死亡過程的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。最近的研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激也可以激活MAPK21。晶狀體中存在的MAPK途徑包括Raf-Mek-ERK、SAPK-JNK和p38MAPK22。但是，氧化應(yīng)激下MAPK如何調(diào)節(jié)AQP1和AQP5的表達(dá)目前仍不清楚23。本文研究結(jié)果顯示，HLECs經(jīng)ERK和p38抑制劑處理后，H2O2介導(dǎo)的AQP1表達(dá)下調(diào)受到抑制，而JNK抑制劑對(duì)AQP1表達(dá)無明顯影響;ERK、p38和JNK的抑制劑均對(duì)AQP5表達(dá)無顯著作用。這表明在HLECs的氧化損傷過程中，MAPK途徑（ERK和p38）在調(diào)節(jié)AQP1表達(dá)中起重要作用，但MAPK途徑不

16、參與AQP5的表達(dá)調(diào)控。綜上所述，白內(nèi)障病人晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞AQP1和AQP5表達(dá)較正常組減少，H2O2刺激可導(dǎo)致HLECs中AQP1和AQP5表達(dá)下調(diào)。MAPK途徑中的ERK和p38途徑均介導(dǎo)H2O2刺激引起的HLECs中AQP1表達(dá)下調(diào);MAPK途徑（ERK、p38和JNK）不參與H2O2介導(dǎo)的AQP5表達(dá)變化的調(diào)控。參考文獻(xiàn)1LIMJC，CABALLEROARREDONDOM，BRAAKHUISAJ，etal.VitaminCandthelens：newinsightsintodelayingtheonsetofcataractJ.Nutrients，2022，12（10）：E314

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