云南疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因ME207表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1、云南疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因ME207表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化摘 要 ：本文驗(yàn)證ME207 對白葉枯病的抗性，本研究根據(jù)受白葉枯病誘導(dǎo)的疣粒野生稻差減文庫中的EST 序列設(shè)計(jì)引物， PCR 擴(kuò)增獲得 ME207 基因全長，構(gòu)建含有ME207 基因的高效表達(dá)載體pCAMBIA1303-ME207，對轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯病菌 Y8 ，在苗期和孕穗期分別對其抗性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)無論是在苗期還是在孕穗期，轉(zhuǎn)基因水稻比對照水稻具有明顯的白葉枯病抗性。該結(jié)果進(jìn)一步表明 ME207 對白葉枯病具有一定的抗性，為揭示云南疣粒野生稻高抗白葉枯病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為將來培育新的抗病水稻品種提供資源。關(guān)鍵詞：疣粒野

2、生稻；ME207 基因；基因轉(zhuǎn)化；抗病性鑒定中圖分類號： S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI ：10.11974/nyyjs.20150832008水稻（ Oryza.sativa）是我國最重要的糧食作物之一。全國水稻種植面積約占糧食作物面積的30%，白葉枯病Bacterial Blight ， BB ）是水稻生產(chǎn)中最重要的病害之一，它是由革蘭氏陰性菌（ Gram-negative bacteria）稻黃單胞菌Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，簡稱 Xoo ）引起的一種維管束病害 1 。我國每年發(fā)生水稻白葉枯病害的面積接近1 億畝次，產(chǎn)量損失達(dá)10 % 30 %，嚴(yán)重

3、時可超過50 % ，甚至絕收 2 。實(shí)驗(yàn)證明，以種植抗病品種為主的綜合防治技術(shù)是控制水稻白葉枯病最為經(jīng)濟(jì)、有效和安全的手段1，3。云南疣粒野生稻對白葉枯病高抗，甚至達(dá)到免疫程度。本研究利用基因工程技術(shù)在栽培稻日本晴中過量表達(dá)ME207 基因編碼的蛋白， 并期望篩選獲得一批抗逆性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，為揭示云南疣粒野生稻高抗白葉枯病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。材料與方法1.1 材料本實(shí)驗(yàn)所用日本晴水稻種子以及云南景洪疣粒野生稻葉片均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供。1.2 方法表達(dá)載體構(gòu)建提取云南疣粒野生稻 RNA ，通過反轉(zhuǎn)錄 cDNA 。以 cDNA 為模板， Primer1 和 Primer

4、2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。表 1 ME207 基因引物序列引物（ primer ） 引物序列（ sequence）（ 5to3 ） 酶切位點(diǎn)Primer1 TGCAGATCTTCTCGCCTTCCTTTCCCTC SpeIPrimer2 CGCACTAGTAGCCCATTGCGTATTTCTGBglII分別提取ME207 基因與 pCAMBIA1303載體的質(zhì)粒并分別進(jìn)行上述兩種酶雙酶切并連接，構(gòu)建pCAMBIA1303-ME207植物表達(dá)載體。 將上述表達(dá)載體通過電擊法導(dǎo)入LBA4404 農(nóng)桿菌中，將農(nóng)桿菌侵染水稻的愈傷組織中，并驗(yàn)證水稻在幼苗期與孕穗期抗白葉枯病能力。結(jié)果與分析2.1 ME2

5、07 基因的克隆提取疣粒野生稻 RNA 反轉(zhuǎn)錄 cDNA ，并以 cDNA 為模板，根據(jù)差減文庫中的 EST 序列設(shè)計(jì)引物， PCR 擴(kuò)增大小為 500 bp 左右的目的 DNA 片段，其大小與預(yù)期結(jié)果一致。2.2 pCAMBIA1303-ME207載體的連接將 pMD19-T-ME207 質(zhì)粒和 pCAMBIA1303 農(nóng)桿菌的質(zhì)粒分別用 SpeI 和 BglII 雙酶切，將酶切產(chǎn)物在 16下進(jìn)行連接。2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的驗(yàn)證結(jié)果挑取測序正確的pCAMBIA1303-ME207重組質(zhì)粒采用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化的平板上挑取幾個單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定， PCR

6、產(chǎn)物電泳均可見與目的條帶大小相同的特異條帶。2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的培育將水稻種子播種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，14d后，誘導(dǎo)出淡黃的愈傷組織當(dāng)愈傷組織長出后。將含有ME207基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸浮液注射入共培養(yǎng)基培養(yǎng)3d左右，將共培養(yǎng)的愈傷組織用加了頭孢拉定的無菌水洗凈后放到潮霉素篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d 左右。把篩選培養(yǎng)基上長出的新的愈傷組織放在分化培養(yǎng)基上，在16 h 光照 /8 h 暗處理?xiàng)l件下進(jìn)行分化培養(yǎng)。大約半個月后，愈傷組織會長出小苗。當(dāng)小苗長到一定大小后，將小苗移入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。2.5 轉(zhuǎn)基因陽性苗的PCR 驗(yàn)證從抗性篩選出來的苗中隨機(jī)選幾株植株，CTAB 法提取其基因組

7、DNA ，進(jìn)行 PCR 鑒定，用目的基因的上下游引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。從 1 %的瓊脂糖跑膠結(jié)果可以看出，每個泳道大約有 500 bp 左右的特異條帶，證明pCAMBIA1303-ME207重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到日本晴中。2.6 轉(zhuǎn)基因水稻苗期抗性鑒定對轉(zhuǎn)基因進(jìn)行溫室培養(yǎng)，生長到5 葉期進(jìn)行苗期注射接菌 Y8 ，從第 5 天開始觀察， 7 d 后進(jìn)行表型調(diào)查，感病品種表現(xiàn)為 5 d 后呈現(xiàn)黃色暈圈， 7 d 后暈圈逐漸變成水漬狀， 最后葉片萎蔫枯死； 抗病品種表現(xiàn)為 5 d 后注射點(diǎn)過敏性壞死，出現(xiàn)褐色菌斑。2.7 轉(zhuǎn)基因水稻孕穗期抗性鑒定將白葉枯病病菌Y8

8、 分離后接入培養(yǎng)基中，經(jīng)48h 培養(yǎng)后，將無菌水加入瓊脂表面， 將菌體濃度調(diào)節(jié)至109 菌體 /mL 。全部接種操作須在菌體懸浮液制備好后3h 內(nèi)完成。剪葉用外科剪刀，刀口長78cm。接種時將剪刀蘸菌體懸浮液，握住水稻將葉子端部剪掉。一般于接種后4 5d開始發(fā)病，最初的癥狀是接近剪口處發(fā)生卷曲。2 個周后，抗性品種只從剪口處擴(kuò)大1 2cm；敏感品種的病斑可發(fā)展至1520cm。圖14 中1，2， 3為轉(zhuǎn)基因植株，4，5為非轉(zhuǎn)基因植株。3 結(jié)論3.1 根據(jù)差減文庫中的EST序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了疣粒野生稻的ME207基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-ME207，并將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿

9、菌LBA4404，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化提供條件。3.2 農(nóng)桿菌 LBA4404介導(dǎo)表達(dá)載體pCAMBIA1303-ME207 1303轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織在含有潮霉素的培養(yǎng)基上獲得水稻的轉(zhuǎn)基因植株。對其中 20 株的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行 DNA 進(jìn)行 PCR 檢測分析，初步證明 ME207 基因已經(jīng)整合到上述水稻中。3.3 通過對轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯病菌Y8作抗性鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗性有顯著提高，表明ME207對白葉枯病具有一定的抗性，為揭示云南疣粒野生稻高抗白葉枯病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為將來培育新的抗病水稻品種提供資源。參考文獻(xiàn)錢韋，謝中穗，葛頌，等，中國疣粒野生稻的分布、瀕?，F(xiàn)狀和保護(hù)前景 J. 植物

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