實驗四細(xì)菌的革蘭染色法

1、關(guān)于實驗四細(xì)菌的革蘭染色法第1頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三一、實驗?zāi)康?、了解革蘭染色的原理。2、掌握革蘭染色的方法。3、掌握細(xì)菌的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)。第2頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三二、試驗原理細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再經(jīng)碘液媒染后，用酒精或丙酮脫色，再用復(fù)染劑（番紅）染色，如果細(xì)菌不被脫色而保持原來染料的藍紫色者，為革蘭氏陽性菌；如果被脫色，而被染上復(fù)染劑的紅色者則為革蘭氏陰性菌。第3頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌染色差別的原因G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密(肽聚糖層厚)，且脂質(zhì)含量少，

2、乙醇不易滲入脫色。 G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松(肽聚糖層薄)，且脂質(zhì)含量多，乙醇溶解脂質(zhì)后易滲入細(xì)胞而脫色。G+菌菌體含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色。 G-菌菌體核糖核酸鎂鹽含量小，易被乙醇脫色。G+菌等電點比G-菌低，在同一pH值條件下陽性菌比陰性菌所帶負(fù)電荷要多，故與帶正電荷的堿性染料(結(jié)晶紫)結(jié)合牢固，不易被乙醇脫色。第4頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三三、試驗材料顯微鏡、酒精燈、火柴、牙簽、載玻片、吸水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯、生理鹽水、蒸餾水草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏（Lugol）碘液、 95%乙醇、蕃紅紅染液口腔中的細(xì)

3、菌第5頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三四、操作步驟1、標(biāo)本片制備取載玻片1塊，加1滴生理鹽水。用牙簽小心輕刮自己舌苔幾下，鹽水中混勻涂成一薄層。在室溫下自然干燥。用片夾夾住玻片通過火焰3次固定標(biāo)本，自然冷卻。第6頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三2、染色初染：在固定好并已冷卻的涂片標(biāo)本上滴加結(jié)晶紫染液，要蓋滿涂膜。約1分鐘后，用細(xì)水流從玻片的一端把游離的染液洗去。媒染（增加染料與細(xì)胞的親和力）：滴加盧戈碘液數(shù)滴，作用1分鐘后，輕輕水洗。脫色：在玻片上加95%乙醇23滴，并輕輕轉(zhuǎn)動玻片數(shù)秒鐘，使玻片傾斜讓乙醇流去，如此重復(fù)數(shù)次，直至流下的乙醇幾乎

4、無色或稍成淡紫色，流水沖洗。復(fù)染：滴加稀釋復(fù)紅染液數(shù)滴，作用12分鐘后流水沖洗。第7頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三3、結(jié)果判定染色完畢，用吸水紙將標(biāo)本片吸干，玻片上滴加香柏油，油鏡觀察。注意觀察菌體的形態(tài)、大小、排列和染色。第8頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三五、注意事項1、決定革蘭染色成敗的關(guān)鍵是脫色程度。若脫色過度，即使是G+菌，其藍紫色也會被脫去而染上紅色，被誤認(rèn)為是G-菌（假陰性）。若脫色不足，即使G-菌也因藍紫色被保留而染不上紅色，被誤認(rèn)為G+菌(假陽性)。脫色程度又受脫色時間、涂片之厚薄、脫色時載玻片搖晃的快慢及酒精用量多少等因

5、素的影響，無法嚴(yán)格規(guī)定。一般可用已知G+菌和G-菌作練習(xí)，以掌握脫色時間。當(dāng)要確證一個未知菌的革蘭反應(yīng)時，應(yīng)同時另作一張已知G+菌和G-菌的混合涂片，以資對照。第9頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三五、注意事項2、涂片以薄而勻為佳，切不可濃厚。過于密集的菌體，因脫色不均勻常呈假陽(陰)性。鏡檢時，要以分散開的細(xì)菌著色為準(zhǔn)。3、做革蘭染色的菌種，以培養(yǎng)1824h為宜。一般情況下G-菌的染色反應(yīng)較穩(wěn)定，不易受菌齡的影響；而G+菌,有的在幼齡時呈陽性，培養(yǎng)24和48h以上，由于細(xì)胞老化或死亡也可變?yōu)殛幮苑磻?yīng)。4、不宜使用放置過久的碘液，以免影響固定結(jié)晶紫的作用。第10頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三六、作業(yè)繪圖：油鏡下觀察到的細(xì)菌及染色狀況。革蘭染色結(jié)果記錄第11頁，共13頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三七、思考題1、試比較革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特征？2、革蘭染色有什么實際意義？3、當(dāng)你對一株未知菌進行革蘭染色時，怎樣能確