常用蛋白還原劑變性劑

1、常用蛋白復原劑及變性劑常用蛋白復原劑及變性劑常用蛋白復原劑及變性劑常用蛋白復原劑1DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，簡稱為DTT），是蘇糖醇的C-1及C-4位羥基置換成巰基的化合物。在生化反響頂用做復原劑，保護蛋白質或酶中的巰基不致氧化而失活。也常用于復原蛋白質分子中的二硫鍵等。DTT是一種小分子有機復原劑，化學式為C4H10O2S2。其復原狀態(tài)下為線性分子，被氧化后變成包含二硫鍵的六元環(huán)狀構造。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）DTT的異構體為二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向異構體。DTT也經常被用于蛋白質中二硫鍵的復原，可用于阻截蛋白質中的半胱氨酸

2、之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵。但DTT經常沒法復原包埋于蛋白質構造內部（溶劑不可及）的二硫鍵，這種二硫鍵的復原經常需要先將蛋白質變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M鹽酸胍、8M尿素或1%SDS）。反之，依據DTT存在狀況下，二硫鍵復原速度的不同樣，。能夠判斷其包埋程度的深淺。-巰基乙醇英文名稱：-Mercaptoethanol，化學式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一種擁有特別臭味的無色透明液體，易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機溶劑。-巰基乙醇(又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、-硫醇代乙醇）是一種有機化合物，其化學式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫

3、為ME或-ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團，為揮發(fā)性液體，擁有較激烈的刺激性氣味。-ME平常用于二硫鍵的復原，能夠作為生物學實驗中的抗氧化劑。它被廣泛使用的原由是它的羥基使它能夠溶解于水中，并且降低它的揮發(fā)性。因為擁有較低的蒸汽壓，它的難聞的狀況比起惡臭的硫醇要好得多。2-巰基乙醇能夠翻開蛋白質中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH，二硫鍵被翻開后能夠使蛋白質的四級或三級構造被損壞。因為2-巰基乙醇能夠翻開蛋白質的構造，它經常被用于蛋白質分析。而2-巰基乙醇也經常被用于保

4、護蛋白質中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。作為復原劑，2-巰基乙醇經常能夠與二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）交換使用。2-巰基乙醇是少量幾種被發(fā)現(xiàn)能夠延伸小鼠壽命的化合物。在微克量級水平上，2-巰基乙醇被察看到對實驗鼠的生命擁有多種可能的正面效應。3.TCEP?化學名稱：三(2-羧乙基)膦；英文名稱：Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）；分子量：250.19。無色透明液體，不溶于脂肪烴，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲苯等，能與氯仿及四氯化碳混溶，與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維素、聚氯乙烯、

5、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。TCEP是一種特別有效的硫醇類復原劑，寬泛用作蛋白質化學及蛋白質組學研究中二硫鍵的定量復原劑。該試劑在水溶液中的堅固性和溶解性都很好。在酸性、堿性溶液中的堅固性也不錯。與其余類其余硫醇類復原劑如DTT比較，TCEP不只是一種高效的二硫鍵復原劑，并且在某些巰基的交聯(lián)反響中不需要除去。因此在蛋白質化學及蛋白質組學研究經常優(yōu)先選擇TCEP。TCEP在很寬的PH值范圍內都能夠選擇性定量地復原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化合物。平常室溫下反響不到5分鐘就能夠達成。TCEP沒有難聞的氣味，并且在空氣中不怕氧化。增補：DTT，beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類復原劑。

6、復原劑能夠保護蛋白質上自由的巰基不被氧化，進而防范蛋白質的齊集或變性。在結晶實驗中，一般使用的復原劑工作濃度是110mM。beta-巰基乙醇是上述三種復原劑中復原能力最差的一個，因為它自己只有一個巰基。它的見效一般只好保持23天。因此，在實驗中要每隔23天補加一次beta-巰基乙醇來維持它的作用。因為beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此，能夠在池液中加入beta-巰基乙醇，利用它的揮發(fā)擴散到液滴中去。二硫蘇糖醇DTT有兩個巰基基團，其作用能保持37天。DTT的揮發(fā)性不像beta-巰基乙醇那么強，因此使用時應當直接加入到懸滴中去。DTT還能夠夠經過微透析的方法加入。TCEP的復原能力比使結晶用的緩

7、沖液酸化。與beta-巰基乙醇和DTT近似，DTTTCEP都強，它的作用能夠保持23周。TCEP需要直接加入到懸滴中，因此能夠考慮微透能析法。beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用系統(tǒng)可能不同樣。像其余增添劑同樣，假如你發(fā)現(xiàn)一類物質對樣品的堅固性和結晶有益，則能夠去優(yōu)選這一類物質中最合適你的樣品的一種。我們建議是，最好這三種復原劑都試一試試看，去發(fā)現(xiàn)最合適的。復原劑能夠與金屬離子聯(lián)合，金屬離子其被復原，而復原劑的作用被控制。這就使得用重金屬原子作同晶置換法碰到了麻煩。能夠使用EDTA來防范復原劑被金屬離子控制。但是，假如金屬離子是你的樣品蛋白保持活性所必然的，就要當心使用EDTA了。堿性

8、條件下，beta-巰基乙醇和TECP更堅固，見效要好于DTT。酸性條件下，TCEP的堅固性也要好過DTT。DTT能夠使Ni被復原，因此在用Ni柱純化His標簽的蛋白時要防范使用DTT，而應該考慮beta-巰基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一種復原劑。在結晶實驗中，半胱氨酸限制性很顯然，那是因為它簡單形成六角形的晶體。可是，半胱氨酸是一種有效的增添劑，能帶來顯然的見效，可是需要銘刻它的限制性。假如預期到蛋白會被氧化，從制備樣品開始就要加入復原劑，并且在整個流程中要不停補加保證其見效。在懸滴法中，能夠在池液里加入復原劑，利用復原劑的揮發(fā)擴散，保證懸滴中復原性的環(huán)境。在確立復原劑和樣品比率時，需要考慮

9、樣品上自由巰基的數(shù)量和樣品濃度。自由巰基數(shù)目越多，樣品濃度越高，復原劑的用量就越大。含砷化合物與復原劑不可以夠共用。二甲胂和二甲胂酸鈉是結晶中常使用的含砷化合物，它們不可以夠與復原劑共同使用。其余不可以夠與復原劑一同使用的物質還包含：硝酸銨，過氧化氫，高氯酸鉀，硝酸鈉。在使用某種物質以前，應當先查閱MaterialSafetyDataSheet(MSDS)。4.SDSSDS是一種陰離子去污劑，它能損壞蛋白質分子之間以及其余物質分子之間的非共價鍵。在強復原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下，蛋白質分子內的二硫鍵被翻開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質分子與SDS充分聯(lián)合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合

10、物，復合物所帶的負電荷大大超出了蛋白質分子原有的電荷量，這就除去了不同樣蛋白質分子之間原有的電荷差別，蛋白質-SDS復合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。SDS不只好夠分別判斷蛋白質，并且能夠依據遷徙率大小測定蛋白質亞基的分子量。DTT和巰基乙醇比較，作用相像，但低好多。并且DTT比巰基乙醇的濃度低DTT的刺激性氣味要小好多，毒性也比巰基乙醇7倍時，二者見效周邊。但DTT價錢略高一些。DTT有兩個巰基公司，巰基乙醇只有一個巰基公司。常用蛋白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度(48mol/L)水溶液時能斷裂氫鍵，進而使蛋白質發(fā)生不同樣程度的變性。同事，還能夠夠經過增大疏水基酸性殘基在水相中的溶

11、解度，降低疏水互相作用。在室溫下46mol/L尿素和34mol/L鹽酸胍，可使球狀蛋白質從天然狀態(tài)轉變至變性狀態(tài)的中點，平常增添變性劑濃度可提升變性程度，平常8mol/L尿素的變性能力強。一些球狀蛋白質，甚至在8mol/L尿素溶液中也不可以夠完滿變性，可是在8mol/L鹽酸胍溶液中，他們一般以無規(guī)則卷曲(完滿變性)構象狀態(tài)存在。尿素和鹽酸胍惹起的變性包含兩種系統(tǒng)：1、變性蛋白質能與尿素和鹽酸胍優(yōu)先聯(lián)合，形成變性蛋白質-變性劑復合物，當復合物被除去，進而惹起ND反響均衡向右挪動。隨著變性劑濃度的著呢國家，天然狀態(tài)的蛋白質不停轉變成復合物，最后致使蛋白質完滿變性?？墒?，因為變性劑與變性蛋白的聯(lián)合是特別弱的。因此，只有高濃度的變性劑才能惹起蛋白質完滿變性；2、尿素與鹽酸胍對誰說氨基酸殘基的增溶作用。因為尿素和鹽酸胍都擁有形成氫鍵的能力，當他們在高濃度時，能夠損壞水的氫鍵構造，結果尿素和鹽酸胍就成為非極性