沙棘原漿蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中理化指標及抗氧化能力的變化

1、PAGE 13 -沙棘原漿蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中理化指標及抗氧化能力的變化沙棘果實含有黃酮、酚類化合物、脂肪酸和維生素A、C、E等多種功效成分,具有很高的生物學(xué)價值1。作為純天然的膳食補充劑,以新鮮的沙棘果實加工而成的沙棘原漿備受消費者歡迎。但沙棘果有機酸含量較高,其中以蘋果酸和奎寧酸為主,約占總酸90%2,原漿口感過于酸澀,無法直接飲用。降低酸度是改善原漿口感的有效方法,目前應(yīng)用于果汁的降酸方法包括物理降酸法、化學(xué)降酸法和生物降酸法。生物降酸法是利用微生物進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF),MLF可將雙羧基的蘋果酸轉(zhuǎn)化為單羧基的乳酸3,從而降低總酸

2、中蘋果酸的含量,口味也會變得更加柔和圓潤。該法因降酸效果明顯,且有助于改善口感和風(fēng)味,因此比其他方法更受歡迎4。具有蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力的微生物主要為乳酸菌中的乳球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬等,MLF用于葡萄酒后發(fā)酵的研究和應(yīng)用已經(jīng)較為廣泛。近年來,將MLF應(yīng)用于高蘋果酸含量果汁的研究越來越多。其中酒酒球菌表現(xiàn)出更強的對低pH果汁的耐受性,其可通過MLF降低高酸度果汁北五味子和青梅汁中蘋果酸含量,同時增強了果汁的抗氧化活性5-6。目前,國內(nèi)有關(guān)沙棘與其他果汁復(fù)合飲料的研究較多,將酒酒球菌應(yīng)用于沙棘果酒也有報道。但對沙棘原漿的MLF尚未見深入研究。本試驗以高酸度大果沙棘原漿為原料,接種酒酒球菌CI

3、CC 6066,測定發(fā)酵過程中有機酸、單糖、黃酮醇、酚酸含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及抗氧化活性的動態(tài)變化,以明確酒酒球菌發(fā)酵對沙棘原漿理化指標、生物活性物質(zhì)的含量及抗氧化能力等的影響,為高蘋果酸含量原漿的利用提供參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑沙棘原漿,張北寶得康食品有限公司；酒酒球菌CICC 6066凍干粉,上海保藏生物技術(shù)中心。ATB培養(yǎng)基,上海瑞楚生物科技有限公司；DPPH、三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine,TPTZ)、ABTS、沒食子酸、檸檬酸、草酸、乳酸、DL-蘋果酸、奎寧酸、槲

4、皮素、山奈酚、異鼠李素、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；香豆素、咖啡酸、阿魏酸、兒茶酸、表兒茶酸,上海麥克林生化科技有限公司；上述所有藥品均為分析純；乙腈、甲醇、冰乙酸(均為色譜純),抗壞血酸(分析純),天津歐博凱化工有限公司。1.2 儀器與設(shè)備PB-21型pH計,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-50DA數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；MultiSkan FC酶標儀,賽默飛世爾科技公司；ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司；C-2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海舍巖儀器有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計、LC-20AT高

5、效液相色譜儀,日本島津公司。1.3 試驗方法1.3.1 發(fā)酵種子液的制備將酒酒球菌CICC 6066凍干粉用0.2 mL的溶解液溶解混合均勻,吸取100 L接種到ATB斜面培養(yǎng)基中,25 培養(yǎng)2 d,從斜面培養(yǎng)基中挑取1環(huán)接入ATB液體培養(yǎng)基中,25 培養(yǎng)2 d,連續(xù)活化2次,將所得菌液離心(4 000 r/min,10 min),并用生理鹽水洗滌2次后再次離心,棄去上清液,收集菌泥；用生理鹽水重懸,調(diào)整細胞濃度為1109CFU/mL作為發(fā)酵種子液。1.3.2 發(fā)酵沙棘原漿的制備沙棘原漿初始pH為2.70,可溶性固形物為12.30%。用NaHCO3(1 mol/L)溶液調(diào)其pH至3.5,調(diào)酸后

6、沙棘漿的色澤無明顯變化,呈橙黃色。然后接種酒酒球菌CICC 6066種子發(fā)酵液,接種量為5%,使初始菌數(shù)達到1107CFU/mL。對接種后沙棘漿進行分裝,每份100 mL分裝于200 mL三角瓶中,置于25 恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵8 d,每2 d取樣分析,并留樣置-80 凍存,備用。1.3.3 微生物及理化指標的測定活菌數(shù)的測定參照GB 4789.352022；pH值使用pH計直接測定；可溶性固形物含量的測定參照NY/T 26372022；總酸的測定參照GB/T 124562022；總糖的測定采用苯酚硫酸法7。1.3.4 有機酸的測定參照文獻8的方法,稍作修改。色譜條件為色譜柱：InertSustai

7、n-C18(4.6 mm250 mm,5 m)；流動相：0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.70)；等度洗脫20 min；流速0.6 mL/min；紫外檢測器,波長210 nm；柱溫30 ；進樣量20 L。準確稱取草酸、抗壞血酸各0.10 g(精確至0.000 1 g),乳酸、奎寧酸各0.20 g,蘋果酸、檸檬酸各0.40 g,流動相定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度分別為1 000、1 000、2 000、2 000、4 000、4 000 mg/L的混合標準溶液。精密移取10 mL沙棘汁至100 mL容量瓶,用流動相定容,然后用0.45 m微孔濾膜過濾后直接進樣。1.

8、3.5 糖和糖醇的測定參照GB 5009.82022的方法。色譜柱：ZXBridge Amide(粒徑3.5 m,4.6 mm250 mm)；檢測器為示差折光檢測器；流動相為90%乙腈水(含0.1%氨水)；流速1.0 mL/min；檢測器溫度40 ；柱溫40 ；進樣量10 L。分別稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇各1 g(精確至0.1 g),用水定容至50 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為20 mg/mL的標準溶液。準確移取1 mL發(fā)酵液到50 mL離心管,加入10 mL水后,再依次加入2 mL ZnSO4和2 mL亞鐵氰化鉀,渦旋1 min,用水定容到25 mL,10 000 r/mi

9、n離心5 min后取上清液,0.45 m微孔濾膜過濾后直接進樣。1.3.6 黃酮醇的測定參照文獻9的方法,略作修改。色譜柱：InertSustain-C18(4.6 mm250 mm,5 m)；流動相：V(甲醇)V(0.4%磷酸水溶液)=5050；等度洗脫45 min；流速1.0 mL/min；紫外檢測器,波長360 nm,柱溫35 ,進樣量20 L。精確稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素各10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標準溶液。準確吸取發(fā)酵液2 mL于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇振蕩1 min,10 000 r/m

10、in離心10 min,取上清液,0.22 m微孔濾膜過濾后直接進樣。1.3.7 酚酸的測定參照文獻10的方法,略作修改。色譜柱：InertSustain-C18(4.6 mm250 mm,5 m)；流動相：A,V(蒸餾水)V(冰乙酸)=991；B,V(蒸餾水)V(乙腈)V(冰乙酸)=67311；流速1.0 mL/min；紫外檢測器,波長280 nm,柱溫30 ；進樣量20 L。梯度洗脫0 min,B：10%；010 min,B：20%；1016 min,B：20%40%；1620 min,B：40%50%；2025 min,B：50%；1630 min,B：70%；3040 min,B：70%

11、10%；4075 min,B：10%。精確稱取香豆素、兒茶酸、表兒茶酸、阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸各10 mg(精確至0.1 mg),分別用甲醇定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標準溶液。樣品處理參照文獻11的方法,發(fā)酵漿中加入乙酸乙酯(體積比為11),充分混勻,萃取3次,取上清液,然后于45 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,蒸干后的剩余部分用4 mL甲醇溶解,溶解液經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾后直接進樣。1.3.8 SOD活力測定發(fā)酵漿離心(8 000 r/min,10 min)后取上清液稀釋10倍,參照GB/T 5009.1712022和郭偉峰等12的方法測定

12、。1.3.9 抗氧化能力的測定OH清除能力的測定采用Fenton法；DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的測定參照文獻清除能力的測定和總抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)測定參照文獻14的方法。1.4 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用Excel 2022、SPSS 26.0軟件進行方差分析和相關(guān)性分析。每個指標測定均重復(fù)3次,取平均值,結(jié)果以平均值標準差表示。2 結(jié)果與分析2.1 沙棘原漿MLF過程中微生物及理化指標的變化沙棘原漿發(fā)酵過程中微生物及主要理化指標變化如表1所示,沙棘漿的活菌數(shù)顯著增加,發(fā)酵第6天達到最高(9.66 lg C

13、FU/mL),沙棘漿pH從初始3.50持續(xù)升高,發(fā)酵第4天達到3.91,與發(fā)酵第8天(3.98)無顯著性差異；而發(fā)酵過程中可溶性固形物、總酸和總糖的含量均顯著降低,這與酒酒球菌以有機酸和糖作為碳源發(fā)酵利用有關(guān)。由于酸性條件下,酒酒球菌優(yōu)先利用有機酸,因此總酸降低幅度較大。沙棘漿發(fā)酵后總酸降低59.61%,總糖降低19.08%,糖酸比從2.40增加到4.80。糖酸比的增加有助于沙棘原漿口感的改善。表1 沙棘原漿發(fā)酵過程中微生物及理化指標的變化Table 1 Changes in microbes and physical and chemical indexes of sea buckthorn

14、 puree during fermentation注：同行小寫字母不同表示組間存在顯著性差異(P0.05)(下同)2.2 沙棘原漿MLF過程中有機酸含量的變化標準有機酸和發(fā)酵沙棘漿有機酸HPLC(分離詳細色譜圖見電子版增強附件圖1和圖2),對比可確定沙棘漿中含有草酸、奎寧酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸和檸檬酸等6種有機酸。發(fā)酵前后沙棘漿中有機酸含量的變化見表2。發(fā)酵前有機酸以DL-蘋果酸和奎寧酸為主,發(fā)酵后有機酸比例發(fā)生了明顯變化,以乳酸和奎寧酸為主。MLF發(fā)酵的重要標志是蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸,發(fā)酵8 d后,沙棘原漿中蘋果酸由22.58 mg/mL降低到3.16 mg/mL,蘋果酸降解率達到8

15、6.01%；結(jié)果還顯示發(fā)酵6 d,蘋果酸含量為3.20 mg/mL,與發(fā)酵8 d無顯著性差異,說明發(fā)酵6 d已達到了蘋果酸降解的最高值；乳酸含量增加了3.79倍,達到29.58 mg/mL。表明酒酒球菌CICC 6066在此沙棘漿發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生蘋果酸乳酸酶,催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。張晟等5優(yōu)化北五味子MLF后蘋果酸降解率達到了59%。本研究計劃下一步優(yōu)化發(fā)酵工藝,以進一步提高蘋果酸降解率。同時,由表2還可看出檸檬酸含量也有所降低,何翠嬋等6用酒酒球菌發(fā)酵青梅汁,也證實該菌可利用檸檬酸作為碳源。另外,發(fā)酵后抗壞血酸含量降低,主要原因可能是抗壞血酸屬于烯醇化合物,化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,容易發(fā)生氧化反

16、應(yīng)形成醌類物質(zhì),洪冰15和郝媛等16的研究也得出相同的結(jié)論。發(fā)酵前后,沙棘原漿中奎寧酸和草酸沒有顯著變化。表2 沙棘原漿發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Table 2 Changes in organic acids of sea buckthorn puree during fermentation2.3 沙棘原漿MLF過程中糖的變化標準糖和發(fā)酵沙棘漿糖HPLC分離詳細色譜圖見電子版增強附件圖3和圖4,通過比對可確定沙棘漿中含有葡萄糖和果糖2種單糖。TKACZ等1從試驗所用沙棘汁中檢測出葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇等5種糖和糖醇,而本試驗從大果沙棘原漿中僅檢測出葡萄糖和果糖2種單糖(表3),

17、所含糖的種類和數(shù)量不同可能與沙棘品種有關(guān)。發(fā)酵過程中,2種單糖含量均顯著減少；發(fā)酵第8天,葡萄糖和果糖分別降低了23.25%和32.17%;表明酒酒球菌具有一定的利用還原糖作為碳源的能力,何翠嬋等6研究也發(fā)現(xiàn)酒酒球菌在添加了葡萄糖的青梅汁中,生長速率顯著加快,葡萄糖對其生長有促進作用。另外,葡萄糖的含量在發(fā)酵4 d時為11.92 mg/mL,此后并無顯著性降低,果糖的降解速度在4 d后顯著變緩慢,說明這2種糖在酒酒球菌進入指數(shù)生長期后(4 d)降解速率均減慢。表3 沙棘原漿發(fā)酵過程中糖的變化Table 3 Changes in monosaccharides of sea buckthorn

18、puree during fermentation2.4 沙棘原漿MLF過程中黃酮醇和酚酸的變化標準黃酮醇、酚酸和發(fā)酵沙棘漿黃酮醇、酚酸HPLC分離詳細色譜圖見電子版增強附件圖5圖8,通過對比可確定沙棘中有槲皮素、山奈酚和異鼠李素3種黃酮醇和沒食子酸、對羥基苯甲酸、兒茶酸、咖啡酸、表兒茶酸、阿魏酸、香豆素等7種酚酸。采用高效液相色譜法測定了沙棘原漿發(fā)酵過程中黃酮醇和酚酸的變化,見表4。沙棘原漿中黃酮醇以異鼠李素為主,占比56.37%。發(fā)酵后各黃酮醇的含量均顯著增加,發(fā)酵第8天,總黃酮醇(3.913 mg/L)較原汁增加了49.35%,可能是部分黃酮類物質(zhì)與不溶性膳食纖維結(jié)合,酒酒球菌發(fā)酵過程中

19、產(chǎn)生的酶,使這部分黃酮釋放為水溶性黃酮苷,導(dǎo)致各黃酮醇含量的增加17。表4 沙棘原漿發(fā)酵過程中黃酮醇和酚酸含量的變化Table 4 Changes in flavonols and phenolic acids of sea buckthorn puree during fermentation除表兒茶酸外,各酚酸也均呈顯著增加的趨勢。發(fā)酵8 d后,總酚酸含量達到156.78 mg/L,較原漿增加了29.63%；酚酸含量最高的仍為沒食子酸,占比33.89%,對羥基苯甲酸和兒茶酸各增加了59.80%和65.50%?？偟膩碚f,可能是由于酚類化合物進行了去糖基化反應(yīng),植物細胞壁上釋放出了可溶性共軛或

20、不溶性的酚類化合物,使得酚酸的含量增高18。2.6 沙棘原漿MLF過程中SOD活力變化乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生一些功能性酶類,如SOD。作為一種體內(nèi)的天然清除劑,SOD活性已成為評價保健食品抗衰老的重要指標19。由圖1可知,沙棘原漿隨著發(fā)酵的進行,SOD活力顯著增加,第8天酶活力達到4 454.54 U/mL,為未發(fā)酵沙棘原漿的8.06倍。圖1 沙棘原漿發(fā)酵過程中SOD活力變化Fig.1 Activity of SOD in sea buckthorn puree during fermentation郭偉峰等12以SOD活力為指標,優(yōu)化桑葚酵素的發(fā)酵工藝后SOD活力提高了123%,可達24 122.2 U/mL。表明乳酸菌發(fā)酵能顯著提高果汁的SOD活力。2.7 沙棘原漿MLF過程中抗氧化能力的變化過量超氧化物自由基的存在