銀杏葉提取物對6OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bax和Bcl2表達(dá)的影響

1、銀杏葉提取物對6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響【摘要】目的討論銀杏葉提取物Ginkgbilbaextrat,GBE對6-羥基多巴胺6-hydrxydpaine，6-HDA誘導(dǎo)的P12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法經(jīng)不同濃度GBE預(yù)處理體外培養(yǎng)的P12細(xì)胞參加6-HDA誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷模型，用4-甲基偶氮唑藍(lán)TT檢測P12細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀F測定P12細(xì)胞凋亡百分比；采用免疫印跡法檢測Bl-2和Bax的表達(dá)程度。結(jié)果100l/L的6-HDA處理P12細(xì)胞24h，細(xì)胞活力較正常對照組明顯降低(P0.01)；與模型組比擬，GBE20，40g/l可明顯減輕6-HDA對

2、P12細(xì)胞的毒性，GBE可使細(xì)胞活性增強(qiáng)，降低凋亡百分比。與正常對照組比擬，模型組Bax表達(dá)升高，而Bl-2表達(dá)降低(P0.05)。與模型組比擬，GBE各劑量組Bax降低，而Bl-2升高，且呈劑量依賴性(P0.05)。結(jié)論GBE對6-HDA誘導(dǎo)的P12細(xì)胞凋亡具有抑制作用，上調(diào)Bl-2和下調(diào)Bax表達(dá)可能是其作用的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】銀杏葉提取物；P12細(xì)胞；6-羥基多巴胺；細(xì)胞凋亡Abstrat:bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetandtheausalehanisfGinkgbilbaextrat(GBE)againstP12ellularapptsisi

3、nduedby6-hydrxydpaine(6-HDA).ethdsDpainergineurnalinjurydelasinduedbyadditinf6-HDAintP12ellsulturedinvitrandpretreatedatdifferentnentratinsfGBE.ellviability,appttiperentage,andtheexpressinfBaxandBl-2ereassayedbyTT,Fandiunbltting,respetively.ResultsThelivabilityfP12ellstreatedith100l/L6-HDAfr24hasler

4、thanthatfthentrlgrup(P0.01).parediththe6-HDAgrup,GBEatnentratinsf20and40g/luldarkedlyrelievethetxiityf6-HDAnP12ells,hihsuggestedthatGBEuldinreasetheellularativityanddereasetheperentagefellularapptsis.TheBaxexpressinasup-regulatedin6-HDAgrupsandBl-2expressinasdn-regulated(P0.05),parediththentrlgrup.p

5、arediththe6-HDAgrup,theBaxexpressinasdn-regulatedandBl-2expressinasup-regulatedinGBEgrups,inadse-dependentanner(P0.05).Thedifferenehadstatistisignifiane.nlusinsAsneftheausalehaniss,GBEhasinhibitryeffetsntheapptsisfthe6-HDA-induedP12ellsbyup-regulatingBl-2expressinanddn-regulatingBaxexpressin.Keyrds:

6、Ginkgbilbaextrat;P12ells;6-hydrxydpaine;apptsis帕金森病(Parkinsndisease,PD)是一種以黑質(zhì)紋狀體通路的退變?yōu)橹饕卣鞯纳窠?jīng)系統(tǒng)變性疾玻近年來許多根底和臨床研究說明，氧化應(yīng)激反響增強(qiáng)在PD黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡中起著主要作用，氧自由基去除系統(tǒng)的缺陷在PD發(fā)病機(jī)制中具有重要的病因?qū)W意義，故采用抗氧化治療正日益成為治療PD的重要手段1-2。氧化應(yīng)激損傷涉及到氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)的失衡，因此，可以通過攝入抗氧化劑限制氧化損傷3。銀杏葉提取物Ginkgbilbaextrat,GBE主要含黃酮甙類、萜類和酚類等，具有去除自由基和過氧化脂質(zhì)、對抗興奮性

7、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、拮抗血小板活化因子等多種藥理活性4，臨床已廣泛用于心腦血管疾病及老年癡呆癥的治療。但GBE對氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元是否有保護(hù)作用，報道甚少。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)12細(xì)胞由于其本身的特性常被用作神經(jīng)元模型。因此，本研究以6-羥基多巴胺(6-hydrxydpaine,6-HDA)損傷P12細(xì)胞為氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元的模型，討論GBE對氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及其防治PD的可能性。1材料和方法1.1主要試劑GBE為德國威瑪舒培博士藥廠產(chǎn)品17.5g/5l，6-HDA為Siga公司產(chǎn)品，AnnexinV-FIT凋亡測定試劑盒購自深圳晶美生物工程，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、4-甲基偶

8、氮唑藍(lán)TT購自美國Ares公司，DE培養(yǎng)基為美國GIB公司產(chǎn)品，新生牛血清、馬血清購自杭州四季青生物工程公司，鼠源Bl-2單抗(-2)(N.s-7382)和Bax單抗(B-9)(N.s-7480)購自北京中杉生物技術(shù)，BA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)研究所。1.2細(xì)胞培養(yǎng)P12細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞所。培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為5%馬血清、10%新生牛血清，1105U/L青霉素、100g/L鏈霉素及2l/LL-谷氨酰胺的DE培養(yǎng)液中，用NaH3和Hl調(diào)pH值至7.07.2完全培養(yǎng)液。于37、5%2條件下培養(yǎng)，每23天換液1次。細(xì)胞80%交融時，用0.125%胰蛋白酶消化，13分瓶傳代。選取

9、對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)展實驗處理。1.3藥物處理細(xì)胞接種24h后給予處理因素。對照組(NS)：P12細(xì)胞正常培養(yǎng)于DE完全培養(yǎng)液中；模型組(6-H)：完全培養(yǎng)液中參加終濃度為100l/L的6-HDA預(yù)實驗以6-HDA25、50、100、150、200l/L孵育P12細(xì)胞6、12、24h和48h后以TT測定細(xì)胞存活率，結(jié)果選定6-HDA100l/L作用24h作為實驗的干預(yù)點，其細(xì)胞生存率為51.6%；GBE低中高劑量組(GL、G、GH)：GBE終濃度分別為10、20、40g/L，通過預(yù)實驗確定作用2h后，參加終濃度為100l/L6-HDA的完全培養(yǎng)液。從6-HDA參加起繼續(xù)培養(yǎng)24h，供檢測。1.4T

10、T法檢測P12細(xì)胞存活率細(xì)胞以2107個/L接種于96孔板，培養(yǎng)24h后進(jìn)展藥物處理，按1.3要求分5組。每組設(shè)6孔，同時設(shè)3孔無細(xì)胞空白對照。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前4h每孔參加TT液20l，置37繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔參加DS150l，振蕩10in，終止反響并充分溶解甲臜顆粒，用全自動酶標(biāo)光度儀進(jìn)展比色,波長為570n，記錄各組的D值D測=D實-D空均，結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。各實驗組P12細(xì)胞活力以各實驗組的D值與正常對照組的D值的比值表示。實驗重復(fù)3次。1.5細(xì)胞凋亡檢測P12細(xì)胞經(jīng)分組加藥處理后，5%2、37培養(yǎng)24h，把細(xì)胞培養(yǎng)液分別吸出，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，胰酶消化

11、。消化下來的細(xì)胞參加轉(zhuǎn)移的原培養(yǎng)液，混勻，1000r/in心5in，棄上清，PBS重懸并計數(shù)。分別取510萬個重懸細(xì)胞，1000r/in離心5in，棄上清，參加195lAnnexinV-FIT結(jié)合液1重懸，參加5lAnnexinV-FIT，混勻。避光孵育10in。1000r/in離心5in，棄上清，參加190lAnnexinV-FIT結(jié)合液1重懸，參加10l碘化丙啶染色液，混勻。FASVantageSE型流式細(xì)胞儀BetnDikinsn，USA檢測細(xì)胞凋亡的情況。1.6免疫印跡檢測Bl-2、Bax的表達(dá)將80%左右交融、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)展消化，制成細(xì)胞懸液2108/L，各取2l參加5個培養(yǎng)瓶，

12、加完全培養(yǎng)液至10l，5%2、37培養(yǎng)至70%左右交融，換含1%新生牛血清的培養(yǎng)液細(xì)胞同步化12h后，按分組要求加藥繼續(xù)培養(yǎng)24h。以預(yù)溫至37的PBS2l洗滌2次，吸干多余PBS。置冰袋上，各參加細(xì)胞裂解液300l，鋪滿細(xì)胞生長面，裂解20in，搜集細(xì)胞于1.5lEP管，4000r/in離心10in，移上清于新EP管，得細(xì)胞處理液。按BA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量含量。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，加1ladingbuffer溶解后直接上樣，剩余溶液低溫儲存(-701個月，-201周，412天)，每次上樣前98，5in。按80g/孔上樣，經(jīng)12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳別離，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移

13、至N膜。經(jīng)3%BSA封閉3h，參加按1300體積比稀釋的Bl-2、Bax鼠源單克隆抗體，4過夜。用洗滌液洗膜，參加相應(yīng)11000體積比稀釋的二抗兔抗鼠，37反響2h。洗膜3次，以NBT/BIP顯色，水洗終止反響。-atin以一樣方法檢測。結(jié)果以Quantityne圖像處理儀Bi-Rad公司,USA處理，進(jìn)展光密度(D)分析，蛋白表達(dá)的變化以實驗組中相應(yīng)條帶的D值相對于-atin的倍數(shù)表示。1.7統(tǒng)計學(xué)處理計量資料用s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)展分析。多組間差異的顯著性分析用單因素方差分析，組間兩兩比擬方差齊用SNK檢驗。檢驗水準(zhǔn)：=0.05。2結(jié)果2.1P12細(xì)胞活力的變化與正常對照組

14、NS相比，模型組6-HP12細(xì)胞的活力顯著下降P0.01，提示6-HDA對細(xì)胞有損傷作用。GBE低中高濃度給藥后，相對于模型組，P12細(xì)胞的活力逐漸進(jìn)步(P0.05)，這種改變呈劑量依賴性，提示GBE在一定范圍內(nèi)對P12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用(表1,圖1)。表1GBE對細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率的影響略NS:正常對照組；6-H:模型組；GL，G，GH：GBE低、中、高劑量組。與正常對照組比擬：P0.05；與模型組比擬：fP0.05圖1流式細(xì)胞儀檢測P12細(xì)胞凋亡略各圖左上角為凋亡細(xì)胞，左下角為正常細(xì)胞，右上角為壞死細(xì)胞2.2P12細(xì)胞凋亡百分比的變化與正常對照組相比，模型組P12細(xì)胞的凋亡百分比顯著增

15、高P0.01，提示6-HDA能誘發(fā)P12細(xì)胞凋亡。相對于模型組，GBE各劑量組的細(xì)胞凋亡百分比均有顯著降低P0.05。說明GBE可以明顯降低6-HDA誘發(fā)的P12細(xì)胞凋亡(見表1,圖1)。2.3GBE對Bl-2和Bax表達(dá)的影響B(tài)l-2是重要的抗凋亡基因，而Bax那么是重要的促凋亡基因。模型組Bl-2的表達(dá)顯著降低，而Bax的表達(dá)那么顯著增加，Bax/Bl-2的比值顯著進(jìn)步，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。與模型組相比，GBE各劑量組Bl-2的表達(dá)逐漸增加，Bax的表達(dá)那么逐漸減少，Bax/Bl-2的比值也逐漸降低且呈劑量依賴性P0.05圖2。圖2免疫印跡法測定GBE對Bax和Bl-2

16、表達(dá)的影響略A：免疫印跡法結(jié)果，-atin為內(nèi)參；B：比色結(jié)果。與正常組比擬：P0.01;與模型組比擬：fP0.05轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論P(yáng)D的主要病理變化是中腦黑質(zhì)和黑質(zhì)紋狀體通路DA神經(jīng)元的變化和缺失。目前，人們對PD發(fā)病機(jī)制仍未明確，但越來越多的研究說明選擇性DA神經(jīng)元損傷和喪失與神經(jīng)元凋亡親密相關(guān)5-6，出現(xiàn)PD病癥的患者其腦內(nèi)DA能細(xì)胞80%以上發(fā)生凋亡7。Tang等8研究認(rèn)為各種病因可經(jīng)由細(xì)胞凋亡這一條共同途徑而導(dǎo)致PD發(fā)病，凋亡是導(dǎo)致PD神經(jīng)元變性的基矗P12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，它能表達(dá)酪氨酸羥化酶并且合成多巴胺，因此也被稱為DA能細(xì)胞。6-HDA是一種神經(jīng)毒素

17、，由于構(gòu)造與DA類似，可被攝入到DA能神經(jīng)元內(nèi)，通過形成羥自由基和抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物和，干擾ATP合成，選擇性引起DA能神經(jīng)元死亡9。所以，本實驗采用6-HDA誘導(dǎo)P12細(xì)胞Bax和Bl-2表達(dá)，從細(xì)胞程度討論GBE對PD的治療作用及可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，6-HDA可以誘導(dǎo)P12細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞存活率降低，成功建立了6-HDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的PD模型，并通過GBE的干預(yù)，采用免疫印跡法檢測了Bl-2和Bax表達(dá)的變化。與正常對照組比擬，6-HDA處理組Bl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，而銀杏葉提取物對Bl-2表達(dá)降低和Bax表達(dá)升高具有抑制作用。正常情況下，多巴胺能神經(jīng)元的凋亡受細(xì)胞內(nèi)

18、基因抑制細(xì)胞凋亡基因、促細(xì)胞凋亡基因和在細(xì)胞凋亡過程中起協(xié)助作用的基因和細(xì)胞外因素的共同調(diào)節(jié)。促凋亡和抗凋亡的Bl-2類蛋白的比例可以調(diào)節(jié)線粒體死亡信號通路，在氧化應(yīng)激環(huán)境下有利于凋亡的發(fā)生。其中Bl-2是重要的抗凋亡基因，Bax那么是重要的促凋亡基因，與Bl-2基因有21%的同源性。Bax/Bl-2的增高改變了線粒體的完好性，引起凋亡特定蛋白如yt，凋亡誘發(fā)因子等的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致aspase-9的活化，最終活化aspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。GBE是具有多種藥理活性的中藥制劑，目前臨床已廣泛用于老年癡呆的治療。有實驗10顯示GBE能防止黑質(zhì)細(xì)胞損傷，對大鼠PD的發(fā)病有一定的預(yù)防和治療作用，為臨

19、床用于PD防治提供了實驗根據(jù)。另一實驗研究證明,GBE可以降低左旋多巴的神經(jīng)毒性，和左旋多巴合用治療PD是個可行的方法，而且效果比單獨使用左旋多巴更好11。本實驗采用不同劑量的GBE作用于P12細(xì)胞，免疫印跡方法觀察JNK介導(dǎo)的非核通路中的Bl-2與Bax的變化，發(fā)現(xiàn)GBE可以增加P12細(xì)胞Bl-2的表達(dá)并抑制Bax的表達(dá)，且具有一定的劑量依賴性。初步提示GBE可能對PD有一定的治療作用，其機(jī)制可能與阻斷神經(jīng)元的非核通路有關(guān)。然而，GBE是藥理作用非常廣泛的中藥制劑，其對于神經(jīng)元凋亡的預(yù)防是主要通過抗氧化作用，還是另有其他途徑？GBE的抗凋亡作用是否只是其神經(jīng)保護(hù)作用的一個方面？還有待于進(jìn)一步

20、深化研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1lan,JankviJ.NeurprtetivetherapyinParkinsnsdiseaseandtrpliatins:Asearhfrapathgenesis-targeted,disease-difyingstrategyJ.vDisrd,2022,20(S11):S3-S10.2BradburyJ.Nehpefrehanis-basedtreatentfParkinsnsdiseaseJ.DrugDisvTday,2022,10(2):80-81.3nyangIG.ithndrialdysfuntinandxidativestressinParkinsnsd

21、iseaseJ.NeurheRes，2022,33(3):589-597.4YshikaaT,NaitY,Knd.Ginkgbilbaleafextrat:ReviefbilgialatinsandlinialappliatinsJ.AntixidRedxSignal,1999,1(4):469-480.5KarunakaranS,DiakarL,SaeedU,etal.Ativatinfapptsissignalregulatingkinase1(ASK1)andtranslatinfdeath-assiatedprtEin,Daxx,insubstantianigraparspatainausedelfParkinsnsdisease:prtetinbyalpha-lipiaidJ.FASEBJ,2022,21(9):2226-2236.6angDQ,ang,JingF,etal.EstablishentfthexidativedaagedelinbrainfPDratsinduedbyL-DPAithir-dialysistehniqueJ.hinPharalBull,2022,2