免疫組化技術(shù)課件

1、 免疫組織化學(xué)技術(shù) （immunohistochemistry） 概念: 指在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)，借助可見的標記物，對相應(yīng)的抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法基本原理 通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體（單克隆或多克?。z測組織、細胞內(nèi)相應(yīng)的抗原物質(zhì)，形成抗原 抗體復(fù)合物；此復(fù)合物上帶有事先標記的標記物，通過與標記物相對應(yīng)的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測組織細胞內(nèi)的抗原，以達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。組織抗原 免疫細胞化學(xué)反應(yīng)原理：標記抗體標記的抗原抗體復(fù)合物間接法 直接法 兩種免疫細胞化學(xué)反應(yīng)方法組織與細胞材料的制備

2、免疫組織化學(xué)方法應(yīng)用組織與細胞材料的制備組織石蠟切片制作組織冰凍切片制作細胞爬片制作細胞涂片制作目的: 使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反應(yīng)，防止細胞自溶，保持細胞固有形態(tài)與結(jié)構(gòu)，防止細胞脫落，去除干擾抗原抗體反應(yīng)的類脂，最主要的是保存組織細胞的抗原性，在染色和反復(fù)清洗的過程中使抗原不致釋放。組織材料的固定組織的脫水脫水就是用某些溶劑將組織中的水分置換出來的過程。不同的組織應(yīng)分開脫水，特別是對一些易脆的組織（肝、脾等）應(yīng)嚴格掌握脫水時間。動物組織的脫水時間應(yīng)比人體相應(yīng)標本時間短脫水應(yīng)按照從低濃度到高濃度的過程。大組織：75乙醇30120min，85乙醇30120min，95乙醇 2h，95乙

3、醇 2h，95乙醇過夜，無水乙醇30 60min，無水乙醇3060min，無水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可視觀察結(jié)果而定），石蠟30min,石蠟12h，石蠟23h。小組織：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、過夜或2h，無水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10min（肉眼觀察），石蠟30min，石蠟30min，石蠟12h。組織石蠟包埋切 片載玻片的清潔： 清潔液浸泡24小時后依次自來水、雙蒸餾水洗，95%酒精浸泡2小時，擦拭干凈。如需開展原位雜交，還需將玻片240烤2h。切片粘合劑的使用：多聚賴氨酸（分子量200KD）：0.

4、05%濃度，浸泡5分鐘，60烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥備用。 切片： 石蠟切片： (1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。 (2)60烤片3-8h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)編上號 (6)切片可在4保存數(shù)年 冰凍切片： 細胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。待細胞生長達到60以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。細胞涂片制作離心將細胞收集出來，用預(yù)冷的PBS洗23遍，最后用PBS將細胞重懸。吸取3050ul（可根據(jù)細胞量調(diào)整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風(fēng)干以后加4多聚甲醛溶液覆蓋細胞，固定24

5、小時。在細胞上加一層甘油放-20保存。 直接加熱法 最常用, 操作方法是將介質(zhì)溶液用燒杯在電爐上加熱至100, 放入切片并保持9510020min, 在室溫中自然冷卻20min即可。熱修復(fù)熱介質(zhì) 0.01mol/L PH6.0 檸檬酸緩沖液, 最常用。微波輻射抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘。 待修復(fù)液自然降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進行染色。隔水熱抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。切片放入0.01M

6、檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達到有效溫度后（92）。即開始計時，持續(xù)40分鐘。待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。胃蛋白酶消化法：主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測, 如纖維蛋白及各類膠原的現(xiàn)示。使用工作濃度為0.4。配制方法: 稱取400mg胃蛋白酶加入到100ml 0.01mol/L HCl中, 組織切片在37消化3060min。 蛋白酶K消化法主要用于原位雜交前標本的處理, 常用的工作濃度為0.025mg/ml(25ug/ml)。配制方法: 稱取0.025mg蛋白酶K加入到1

7、mlPK緩沖液中。(PK緩沖液: 1mol/L PH8.0的Tris-Hcl 10ml;0.5mol/L EDTA 10ml; 雙蒸水80ml, 三液充分混合即可)。組織切片中內(nèi)源性酶的阻斷內(nèi)源性過氧化物酶主要存在于紅細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和組織內(nèi)。阻斷方法：最常用0.3%0.5%H2O2-甲醇液，作用1530min，阻斷液必須使用時新鮮配制。由于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶常同時導(dǎo)致被測抗原變性（使特異性著色減弱），而大部分組織不含有內(nèi)源性過氧化物酶，所以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶一般不必作為常規(guī)步驟。免疫染色標記抗體與標本中抗原反應(yīng)并形成抗原抗體復(fù)合物；用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分；直

8、接在顯微鏡下觀察結(jié)果（免疫熒光直接法），或待標本顯色后再用顯微鏡觀察結(jié)果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟。熒光標記免疫組織化學(xué) 直接法 間接法 免疫熒光技術(shù)將 熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位 免疫熒光技術(shù) .異硫氰酸熒光素 FITC .四乙基羅達明 .四甲基異硫氰酸羅達明 .藻紅蛋白 呈現(xiàn)不同的熒光： 綠色熒光 (FITC) 橙色熒光 橙紅色熒光 紅色熒光等 熒光素 作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物 熒 光： 在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光并隨照射停止而消失 熒光顯微鏡：

9、 熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如 紫外光、藍紫光（有不同的波長范圍）， 使受檢標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光海馬細胞 微管蛋白 綠色(胞體、樹突) 軸突終末蛋白 紅色(突觸) 培養(yǎng)的成纖維細胞 微管呈綠色 核呈藍色免疫酶組織化學(xué)酶標記抗體法非標記抗體免疫酶法多聚螯合物酶法酶標記抗體法是用結(jié)合物將酶標記（共價鍵或非共價鍵方法結(jié)合）在抗體分子上，通過抗原-抗體反應(yīng)使抗原-抗體復(fù)合物上帶有酶分子，再借助酶對底物的特異性催化作用，在抗原-抗體反應(yīng)部位形成不溶性有色產(chǎn)物，在顯微鏡下觀察組織中抗原的性質(zhì)和分布。可用作標記抗體的酶有多種，但最常用的為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidas

10、e, HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）其方法可分直接法和間接法兩種。直接法直接法是將酶（如HRP）直接標記在特異性抗體上，然后與組織中的相應(yīng)抗原相結(jié)合，形成抗原-抗體-HRP復(fù)合物，最后進行顯色。 間接法間接法也稱夾心法，是將酶標記在第二抗體上（第二抗體為抗第一抗體的抗體），形成抗原-第一抗體-第二抗體-HRP復(fù)合物，然后進行顯色。該法要求第二抗體與第一抗體應(yīng)是不同種屬的動物產(chǎn)物。間接法應(yīng)用廣泛，只需標記一種二抗就可以檢測眾多相同種屬來源的一抗。免疫組化SP法的基本步驟（1）石蠟切片脫蠟至水。 （2）抗原修復(fù)（3）3% H2O2室溫孵育510min，以

11、消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。（4）蒸餾水沖洗，PBS洗。（5）5%10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的第一抗體或即用型第一抗體，37孵育2h或4過夜。（6）PBS沖洗，5min3次。（7）滴加適當比例稀釋的二抗，37或室溫孵育1030min。 （8）PBS沖洗，5min3次。（9）滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋）或辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37或室溫孵育1030min。（10）PBS沖洗，5min3次。（11）顯色劑顯色（DAB或AEC）。（12）自來水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。2

12、、非標記抗體免疫酶法在酶標記抗體過程中可降低部分抗體和酶的活性，使得抗體的效價降低。另外，血清中的非特異性抗體也可被酶標記，引起非特異性背景。非標記抗體免疫酶法是先用酶（HRP或AKP）去免疫動物，使其產(chǎn)生抗酶抗體，再將該抗酶抗體與酶結(jié)合，形成五環(huán)的復(fù)合物，例如PAP（HRP）、APAAP（AKP）等復(fù)合物。該復(fù)合物由于沒有一個抗體受到共價鍵標記，保留了免疫活性，因此敏感性大大提高。非標記抗體免疫酶常用的有酶橋法，辣根過氧化物酶抗辣根過氧化物酶復(fù)合物（peroxidase antiperoxidase complex method, PAP）法、堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復(fù)合物（APAAP）法。3

13、多聚螯合物酶法該法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基酸為骨架與抗體結(jié)合，將抗體（一抗或二抗）與HRP結(jié)合在一起，形成葡聚糖+HRP+抗體的巨大復(fù)合物，然后通過酶的底物進行顯色。該法簡便、敏感性高。其方法包括EPOS法（enhanced polymer one-step staining）、EnVision法（又稱為ELPS法 enhance labelled polymer system）、UIP法、Power Vision法。EnVision法是通過葡聚糖將酶與二抗結(jié)合，形成酶-多聚化合物（葡聚糖）-第二抗體巨大復(fù)合物。每個復(fù)合物中含有約70個分子的HRP和10個分子的第二抗體。因復(fù)合物的HR

14、P絕對數(shù)是遠高于其他復(fù)合物，故具有高度的放大效果。流程為抗原+第一抗體+第二抗體（標記有葡聚糖合酶）通過底物顯色。EnVision法步驟石蠟切片至水，PBS洗酶消化或熱處理，作抗原修復(fù)3%H2O2 甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10-20minPBS洗5min3次滴加一抗37 60min或4過夜PBS洗5min3次滴加EnVision復(fù)合物30min(濕盒內(nèi)室溫或37)PBS洗5min3次DAB顯色水洗復(fù)染，常規(guī)封片免疫組化結(jié)果的判斷免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。 陽性反應(yīng)的染色特征陽性反應(yīng)染色分布有四種類型：細胞間質(zhì)、胞漿、細胞核、細胞膜表面。 陽性細胞分

15、布呈灶性和彌漫性。 由于細胞內(nèi)含抗原量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性。陽性細胞染色定位于單個細胞，且與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。 切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域，壞死或擠壓的細胞區(qū)，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。注意事項一、抗體的保存 濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在 4 冰箱內(nèi)，保存時間可達1-3年。 即用型抗體：理論上在4 冰箱內(nèi) 可保存半年左右。 PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般 只可放置1-2個月。二、出現(xiàn)假陽性的原因 組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣 的組織著色過深，不能作為判斷

16、陽性的依據(jù)。 出血和壞死：紅細胞的內(nèi)源性過氧化物酶，壞死細胞釋放的內(nèi)源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 抗體的交叉反應(yīng)。三、出現(xiàn)假陰性的原因 固定時間過長，浸蠟、烤片溫度過高，導(dǎo)致抗原丟失，無法補救。 固定液不合適或濃度不對，導(dǎo)致固定不佳。最好使用10%中性福爾馬林。 抗體濃度過低。 孵育時間太短，或孵育溫度太低。 緩沖液pH值不正確。四、必須嚴格設(shè)置陽性對照和陰性對照。五、DAB有致癌性，用后不應(yīng)隨處倒棄。免疫組織化學(xué)技術(shù)操作過程中的注意事項：新購置的抗體需做預(yù)實驗，一是摸索一抗的最低工作濃度，如廠家提供的說明書上建議工作濃度為1：100，應(yīng)設(shè)1：50，1：100，1：200進行預(yù)實驗，二是

17、觀察一下該抗體的質(zhì)量，是否有陽性表達，有些抗體在制作、運輸、放置等過程中會使抗體效價減低或失活。免疫組織化學(xué)操作以手工為主，由于試劑（如緩沖液、顯色液、封閉液等）時間、溫度的不同會出現(xiàn)不同的結(jié)果（常見的為陽性強度、背景及襯染的深度）影響結(jié)果的分析。因此，每批實驗標本應(yīng)一次性操作完畢，否則會失去每組（實驗組別）之間的可比性。從滴加一抗以后每個步驟切片均不能干涸，否則會出現(xiàn)假陽性或整張切片均呈陽性色。有些抗體，修復(fù)抗原時間不宜過度，否則會出現(xiàn)假陽性，如存在胞漿內(nèi)的抗原在核內(nèi)出現(xiàn)陽性表達，或定位于核內(nèi)的蛋白會出現(xiàn)胞漿陽性，這種現(xiàn)象原因很多，抗體不純也可能是一種原因，但也有一些可能目前還沒有發(fā)現(xiàn)的原因

18、。每次實驗需設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性對照是將明確含有所測抗原的切片與待檢切片同時進行操作，其目的是排除假陰性。陰性對照包括陰性組織對照，陰性試劑對照，陰性組織對照是將已明確無所測抗原的切片與待檢切片同時操作，陰性試劑對照，即對照片以PBS或血清代替一抗，其它均與待檢切片同步進行。其目的是排除假陽性。每次實驗需做操作步驟記錄，以便在實驗出現(xiàn)失敗時便于對失敗原因的分析。免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于病原體感染的早期診斷，自身抗體檢測，分析淋巴細胞表面標記物質(zhì)及抗原、抗體的免疫組化定位等；在病原生物學(xué)方面，主要用于菌種的堅定和抗原結(jié)構(gòu)的分析；在細胞免疫學(xué)檢測中，用以檢測淋巴細胞表面的各種CD抗原、免疫球蛋白受體、HLA抗原和各種膜受體等。 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定位檢測。組織切片中的各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細胞、病毒、腫瘤抗原、漿細胞中的免疫