當歸對宮內缺氧幼年大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元與學習能力的影響及機制

1、當歸對宮內缺氧幼年大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元與學習才能的影響及機制【摘要】目的討論宮內缺氧對幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元與學習才能的影響，以及NDAR1RNA在其新生期的表達與當歸的調控作用。方法安康SD孕鼠30只，隨機分為對照組、缺氧組和當歸組各10只，于孕14d開場將缺氧組與當歸組孕鼠用三氣培養(yǎng)箱制作胎鼠宮內缺氧模型，當歸組用250g/L當歸靜脈注射干預。3組孕鼠分娩當日每窩隨機選取新生鼠2只，取腦、常規(guī)石蠟切片;余新生鼠隨機選取2只喂養(yǎng)至30d進展rris水迷宮測試，測試完畢當日，多聚甲醛灌注固定取腦、常規(guī)石蠟切片。幼鼠腦組織作NSERNA原位雜交、新生鼠腦組織作NDAR1RNA原位雜交。結果r

2、ris水迷宮實驗和NSERNA原位雜顯示：與對照組(n=20)相比，缺氧組幼鼠(n=20)空間探查測試和對位探查測試時間較縮短、海馬A3區(qū)陽性細胞數(shù)減少(P0.05)，當歸組(n=20)探查測試時間較缺氧組延長(P0.05)、海馬A3區(qū)陽性細胞數(shù)增多(P0.05);NDAR1RNA原位雜交顯示：與對照組相比，缺氧組海馬A3區(qū)陽性細胞積分光密度值增大，當歸組較缺氧組減小(P0.05)。結論宮內缺氧可致新生大鼠海馬A3區(qū)NDAR1RNA表達增高，從而使幼年大鼠該區(qū)神經(jīng)元減少，學習記憶才能降低，而當歸注射液可改善宮內缺氧狀態(tài)，增加幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，進步其學習記憶才能?！娟P鍵詞】海馬;學習

3、才能;N-甲基-D-天門冬氨酸受體1;缺氧;當歸Abstrat：bjetiveTexplretheeffetfintrauterinehypxianhippapalA3areaneurnsandlearningapaityfjuvenilerats,andtexplretheexpressinfN-ethy-D-aspartatereeptr-1(NDAR1)inhippapalA3areafnenatalratsfllingintrauterinehypxiaandtheregulatryehanisfAngeliasinensis.ethdsThirtyhealthypregnantSDr

4、atseredividedrandlyintntrlgrup,hypxiagrupandAngeliagrup.HypxiagrupandAngeliagruppregnantratsereadetheintrauterinehypxiadelffetalratsiththethree-gasinubatrfrthebeginningfpregnant14thday,andtheratsfAngeliagrupereintervenedithAngeliasinensisinjetin.Afterbirth,tnenatalratsereseletedrandlyfreahlitterttak

5、ethebraintissue,akeparaffinsetinsnventinly.Tnenatalratsereseletedagainrandlyfrthethersineahlittertperfrfrrisaterazeafterthe30thdayfbirth,andperfusedparafraldehydeattheendfthelastday,tkthebraintissuefjuvenilerats,andparaffinsetinsnventinly.TheexpressinfNSERNAandNDAR1RNAeredetetedbyusinginsitehybridiz

6、atin.ResultsInhypxiagrupjuvenilerats(n=20),thesearhingtiefprbetrialandreveralprbetrialinthetargetquadrant,andthequantityfpsitiveNSERNAellsinhyppapalA3areaerelessthanthatfntrlgrup(n=20)(P0.05);andthatfAngeliagrup(n=20)asrethanthatfhypxiagrup(P0.05).Theintegralptialdensity(ID)valuefpsitiveNDAR1RNAells

7、inhippapalA3areainhypxiagrupnentalrats(n=20)assignifiantlyhigherthanthatfntrlgrup(n=20)andalshigherthanthatfAngeliagrup(n=20)(P0.05).nlusinIntrauterinehypxiaaninreasetheexpressinfNDAR1RNAinhippapaldentategyrusfnentalrats,thusreduedthequantityfhippapaldentategyrusneurnsandlearning-eryapaityfjuveniler

8、ats,hileAngeliasinensisinjetinaniprvetheintrauterinehypxinditin,thusinreasethequantityfhippapaldentategyrusneurnsandlearning-eryapaityfjuvenilerats.Keyrds：Hippapus;Learningapaity;NDAR1;Hypxia;Angelia宮內缺氧是胚胎發(fā)育中的常見病癥，多種疾病可引起胚胎宮內缺氧。神經(jīng)系統(tǒng)在胚胎發(fā)育中出現(xiàn)最早，其細胞對缺氧極為敏感。因此，研究缺氧及藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的影響具有重要的臨床意義。已有研究證實當歸對一定時間、一定氧

9、濃度宮內缺氧腦組織有一定保護作用1，王東紅等2研究發(fā)現(xiàn)宮內缺氧可致生后小鼠發(fā)育期頂葉皮質神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并可引起成年小鼠學習記憶才能降低，但其宮內缺氧模型較原始。目前，關于當歸調控宮內缺氧后海馬NDAR的表達與神經(jīng)元和學習才能關系的研究未見報道。本實驗采用改進的大鼠宮內缺氧動物模型、rris水迷宮實驗和NDAR1RNA固相原位雜交方法在此方面進展研究，為宮內缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的遠期影響及可能機制提供理論基矗1材料與儀器1.1試劑與儀器大鼠NSERNA、NDAR1RNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;250g/L的當歸注射液(批號：070823)購自武漢大學中南醫(yī)院。三氣培養(yǎng)箱購自美國

10、REVPANY;切片機購自德國LEiaPANY;rris水迷宮跟蹤系統(tǒng)購自成都泰盟公司。1.2動物分組30只成年孕14d的SD雌大鼠(由瀘州醫(yī)學院動物實驗中心提供，一級合格動物，答應證號：川實動管質第17號)隨機分為對照組、缺氧組和當歸組各10只。2方法2.1宮內缺氧動物模型參照本實驗小組前期制作的宮內缺氧模型3，但延長缺氧時間。當歸組孕鼠自孕14d開場，每天下午2：00經(jīng)尾靜脈注射250g/L的當歸注射液8l/kg，1h后放入設置好的三氣培養(yǎng)箱(氧體積分數(shù)130l/L，溫度25，二氧化碳體積分數(shù)0.40.6l/L)內缺氧2h，連續(xù)缺氧5d(孕第1418天)。第19天、20天仍給予當歸注射，但

11、不缺氧。缺氧組用生理鹽水代替當歸注射液，其余同當歸組。對照組不缺氧，余同缺氧組。2.2新生鼠處理各組孕鼠待其自然分娩(每只孕鼠產(chǎn)仔鼠58只)，產(chǎn)后每窩隨機取新生鼠2只(每組得新生鼠20只)，在前囟后約1處取腦、40g/L多聚甲醛固定40in、常規(guī)脫水石蠟包埋(試劑中均含1g/L的DEP)、經(jīng)海馬冠狀切面切片(厚5)，取組織塊中肉眼可見海馬后的第20張切片備用。每窩剩余新生鼠隨機選取2只喂養(yǎng)至30d(每組得幼鼠20只)。2.3rris水迷宮實驗將30日齡的幼年大鼠進展11d的水迷宮測試。詳細參照rris水迷宮實驗方法4。四象限階段訓練，每象限間隔10in，假設訓練時下水時間達60s仍未找到平臺，

12、那么引導大鼠到平臺，讓其在平臺上停留10s，連續(xù)訓練5d，第6天(35日齡)行無平臺60s的空間探查測試，記錄在目的象限的探查時間T1。第7天開場維持4d的對位訓練，訓練方法同前，僅平臺移至對側象限，第11天(40日齡)進展60s的無平臺對位探查測試，記錄在目的象限的探查時間T2，實驗中保持每次實驗室環(huán)境不變。2.4幼鼠取材幼鼠于水迷宮測試完畢當日(40日齡)經(jīng)40g/L多聚甲醛灌注固定1h、在前囟后約3處取腦、后固定1h，DEP水洗滌，梯度酒精脫水(以上液體均含1g/L的DEP)。常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)海馬冠狀切面切片(厚5)，取組織塊中肉眼可見海馬后的第50張切片備用。2.5原位雜交、照相新生鼠

13、腦組織切片作NDAR1RNA原位雜交，幼鼠腦組織切片作NSERNA原位雜交，步驟按說明書進展(其中胃蛋白酶消化時間為6in)，DAB避光顯色510in(鏡下控制顯色時間)，切片常規(guī)脫水、透明、封片。每張切片在400下用LYPUSAx-70顯微成像系統(tǒng)(日本LYPUS光學儀器)對海馬A3區(qū)拍照。2.6圖像分析及統(tǒng)計學處理采用Iage-PrPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(ediaybernetis公司軟件)，對每張NSERNA的400圖片均在海馬A3區(qū)錐體細胞層一樣區(qū)域選取一樣大小面積進展圖像分析，統(tǒng)計其陽性細胞數(shù)量;各NDAR1RNA的400圖片在海馬A3區(qū)一樣區(qū)域(包括分子層、錐體細胞層和多形細胞

14、層)選取一樣大小面積進展圖像分析，統(tǒng)計陽性細胞的ID值。數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS13.0軟件包進展單因素方差分析。3結果3.1rris水迷宮結果缺氧組幼鼠空間探查測試時間(T1)和對位探查測試時間(T2)，較對照組縮短，而當歸組T1和T2較缺氧組延長(見表1)。表13組幼年大鼠rris水迷宮測試T1和T2比擬與對照組比擬，#P0.05;與缺氧組比擬，P0.05;n=203.2各組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA的表達NSERNA原位雜交陽性細胞胞質染為棕黃色，以胞體著色為主,陽性細胞主要集中在海馬皮質錐體層。對照組A3區(qū)陽性細胞染色深，陽性細胞數(shù)多而密集(見圖1);缺氧組海馬A3區(qū)陽性細胞染色減弱

15、，數(shù)量明顯減少，細胞稀疏，錐體細胞層變窄(見圖2);當歸組A3區(qū)陽性細胞染色變深，細胞數(shù)量增多，錐體細胞層變寬，但細胞不如對照組嚴密(見圖3)。各組NSERNA陽性細胞數(shù)比擬見表2。3.3各組新生鼠海馬A3區(qū)NDAR1RNA的表達NDAR1RNA原位雜交陽性細胞胞質染為棕黃色，海馬A3區(qū)三層均可見陽性細胞，但以錐體細胞層為主。對照組A3區(qū)錐體層陽性細胞密集、染色淺，分子層和多形細胞層的陽性細胞較稀疏(見圖4);缺氧組A3區(qū)陽性細胞染色明顯加深，分子層和多形細胞層也有較多陽性細胞(見圖5);當歸組A3區(qū)分子層和多形細胞層仍有較多陽性細胞，但各層陽性細胞染色較缺氧組明顯減弱(見圖6)。各組新生鼠海

16、馬A3區(qū)NDAR1RNA陽性細胞的ID值見表2。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.4討論已有研究說明，學習記憶的構造根底是大腦邊緣系統(tǒng)，特別是海馬A3區(qū)，是動物形成空間區(qū)分性學習記憶過程的重要構造。在此構造中，海馬A3區(qū)神經(jīng)元又是參與學習記憶功能的重要細胞，因此，該區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)構造與功能的變化必然導致其學習記憶才能的變化。本實驗原位雜交結果發(fā)現(xiàn)缺氧組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA陽性細胞(NSE是神經(jīng)元的特異性標記物)數(shù)量較正常對照組減少，而當歸組NSERNA陽性細胞數(shù)量較缺氧組升高;同時rris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)缺氧組幼鼠學習記憶才能降低，而當歸組幼鼠的學習記憶才能增強結合各組學習記憶才能的變化。結果說

17、明，宮內缺氧可導致幼鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元的減少、學習記憶才能的降低;而當歸注射液可增加宮內缺氧大鼠在幼年期海馬A3區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量、進步幼鼠學習記憶才能。表2各組幼鼠NSERNA陽性細胞數(shù)與新生鼠NDAR1RNA陽性細胞的ID值研究說明,N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-ethy-D-aspartatereeptr,NDAR)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸谷氨酸的離子型受體，包括NDAR1和NDAR2兩個亞基，前者是功能亞基，后者是調節(jié)亞基5。由于NDAR1的分布和含量可以代表NDAR的分布和含量，本實驗僅對NDAR1RNA的表達進展檢測。而NDAR被認為是學習記憶形成和維持的關鍵物質，它可調控神經(jīng)元

18、的存活或死亡，樹突、軸突構造發(fā)育及突觸可塑性，影響神經(jīng)元回路的形成6。NDAR是海馬、皮層長時程增強(1ng-terptentiatin，LTP)形成和維持的關鍵，通過與其配體谷氨酸結合，引起由G蛋白介導的一系列反響，包括a2+內流、激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶、PK和酪氨酸激酶(PTK)通路等，共同作用產(chǎn)生LTP，而LTP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的一種形式，是記憶形成和穩(wěn)固過程中神經(jīng)元活動的客觀過程和指標7，其中NDAR調節(jié)的鈣離子內流對a2+的通透性比Na+、K+高10倍8，從而保持神經(jīng)元正常的生理功能，在LTP的誘導和維持、空間記憶形成以及新記憶向長時記憶的轉化中發(fā)揮非常重要的作用9。本實

19、驗中對照組新生大鼠NDAR1RNA也有較高程度的表達，這是其維持幼年期正常的學習記憶才能的基矗同時實驗結果也說明，胚胎晚期的宮內缺氧明顯上調了新生大鼠NDAR1RNA的表達。既往國內外的研究結果說明，持續(xù)刺激谷氨酸的NDAR可產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應10，是神經(jīng)退行性疾病的重要機制11，發(fā)育期腦受到多種興奮毒性病理因素如缺血缺氧、驚厥等損傷后不僅在急性期會影響NDAR的表達和功能，而且可以引起遠期NDAR的構造和數(shù)量發(fā)生改變，使得腦的興奮性異常，從而對腦發(fā)育產(chǎn)生長期影響12，13。因為NDAR參與學習記憶、突觸發(fā)育的可塑性過程，其表達增加、活性增高后必然對其介導的反響產(chǎn)生增強作用，增強興奮性突觸傳遞，

20、干擾LTP的形成并導致神經(jīng)網(wǎng)絡突觸重建，還可通過-fs等基因的表達上調aspase-3、NF-KB等活性物質，從而誘導神經(jīng)元凋亡、脫失，最終引起學習記憶功能障礙14。因此，本實驗中缺氧組幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的減少，可能是由于宮內缺氧后其急性期新生大鼠NDAR1RNA的表達增加所引起的遠期效應，從而減弱了幼鼠的學習記憶才能。由此可見，胚胎期或新生期機體腦內NDAR較成體較高的表達是腦發(fā)育中形成學習和記憶及神經(jīng)系統(tǒng)可塑性所必需的;但當損傷因素存在時NDAR的過高表達又可損傷神經(jīng)系統(tǒng)。因此，研究發(fā)育中腦損傷，尤其是損傷保護，必須重視NDAR表達的“雙刃劍作用，既要想方法抑制損傷時NDAR的過

21、度增高，又要維持腦發(fā)育所必需的一定量的NDAR表達，而不能簡單地使用NDAR阻斷劑完全阻斷NDAR的表達。因此在治療上，中藥表現(xiàn)得更具有可行性。本實驗中，在使用當歸注射液之后明顯下調了新生鼠A3區(qū)NDAR1RNA的表達，但仍維持較高程度，結合該組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA的表達和水迷宮實驗結果，可見當歸注射液既抑制了腦興奮性的過度增高，又維持了腦發(fā)育所必需的一定快樂奮性，防止了神經(jīng)元的凋亡、脫失，從而保證了學習記憶才能的形成和維持，反映在該組大鼠在幼年期海馬A3區(qū)NSERNA陽性細胞的增多，學習記憶才能的增強。當歸有效成分，如藁本內酯、當歸多糖、當歸揮發(fā)油、氨基酸、微量元素等15，16具有抗血

22、小板聚集和血栓形成、擴血管、去除氧自由基等作用17，18，藁本內酯可通過減小氧化應激和抗細胞凋亡來保護缺血再灌注損傷對大腦的傷害，此外藁本內酯可增加缺血損傷小鼠大腦皮層原癌基因Bl-2的表達，同時降低Bax和aspase-3的表達18。研究說明妊娠期高血壓可致患者外周血管內皮祖細胞數(shù)量減少、功能減退19，而當歸注射液對損傷的血管內皮有保護作用20。Kang等21研究發(fā)現(xiàn)當歸屬的根中提獲得到的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神經(jīng)保護作用，通過多種機制減少過度活化的NDAR引起的a2+內流，降低NDA引發(fā)的細胞毒作用?？梢姰敋w注射液通過下調缺氧后NDAR1RNA的表達，從而減弱NDAR1高表達對

23、神經(jīng)元的損傷，從而改善宮內缺氧后幼年大鼠的學習記憶才能?！緟⒖嘉墨I】1uYL，ZhaHX，YuH.PrtetiveeffetfAngeliasinensisnerebralneurnsfrratebrysunderhypxiaJ.NeuralRegenRes，2022，2(1)：46.2王東紅，王俊波，凌樹才.宮內缺氧對新生鼠頂葉皮質神經(jīng)元內nNS表達及對成年小鼠學習記憶才能的影響J.解剖學報，2022，39(2):170.3YueHS，henXD，ZhngX，eta1.EffetfAngeliasinensisnneuralsteellprliferatininnenatalratsflli

24、ngintrauterinehypxiaJ.NeuralRegenRes，2022，3(7)：733.4吳俊芳,劉忞.現(xiàn)代神經(jīng)科學研究方法,第1版.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2022:696.5QiuS，HuaYL,YangF,eta1.SubunitasseblyfN-ethyl-d-aspartatereeptrsanalyzedbyflureseneresnaneenergytransferJ.JBilhe，2022，280(26):24923.6KuarA，ZuL，YuanX，etal.N-ethyl-D-aspartatereeptrs:transientlssfNR1/NR2A

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