treg淋巴細(xì)胞檢測報告解讀

1、1、Treg細(xì)胞概述高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應(yīng)用使臨床器官移植的急性排斥反應(yīng)大大 降低，移植物的存活時間明顯延長；器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者 生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用（如對重要臟器的損 傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等）及對治療慢性排斥反應(yīng)效果較差等問題，均 限制了免疫抑制劑的長期應(yīng)用。因此，相關(guān)生命科學(xué)工作者嘗試通過誘導(dǎo)移植免 疫耐受途徑來避免免疫抑制劑的長期應(yīng)用及克服移植免疫排斥反應(yīng)。在上個世紀(jì)九十年代中期，由Sakaguchi等首先證實(shí)了天然CD4+ CD25+調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）為一類具有免疫抑制作用的

2、T細(xì)胞，約占 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）2%5%,約占外周CD4+T細(xì)胞的5 10%。該 類細(xì)胞以“主動的方式參與免疫應(yīng)答/免疫耐受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐 受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。2、Treg細(xì)胞的來源研究證實(shí)，天然的CD4+CD25+Treg細(xì)胞來源于胸腺，小鼠出生后第3天 切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞，產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫 性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表現(xiàn)自身免疫 性疾病。這說明出生3d內(nèi)是胸腺產(chǎn)生CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵時期，這 時切除胸腺引起自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過度增殖。但是，出

3、生第0天胸腺產(chǎn) 生的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞不足，出生第7天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的 CD4+CD25+Treg細(xì)胞，所以這時切除胸腺，小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。 Papiernik等證實(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，然后遷移至U外周發(fā)揮 作用，CD4+CD25+胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg細(xì)胞一樣，表現(xiàn)對經(jīng) 由TCR的抗原刺激呈低反應(yīng)性，并且顯示抑制其他T細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生需要TCR與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞的MHC II類分子 間的高親和力作用，MHC II類分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞。 CD4+CD25+Treg細(xì)胞

4、除了在胸腺產(chǎn)生以外，還可以在未成熟的樹突狀細(xì)胞、 IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)變 而來，該類細(xì)胞稱為誘導(dǎo)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞。3、Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記CD25 : Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡，增加免疫耐受。研究表明，多 種T細(xì)胞分子抗原參與Treg細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定Treg細(xì)胞主要 是通過CD4和CD25來標(biāo)記。但隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)覺只通過 CD4+CD25+雙陽性來定義的Treg細(xì)胞并不完全準(zhǔn)確?？乖肿颖磉_(dá)及其功能CD4+與MHC II類分子結(jié)合；主要表達(dá)在Th細(xì)胞上CD25+表達(dá)于大

5、部分Treg細(xì)胞上CD3+表達(dá)于所有T細(xì)胞上，是TCR的組成部分GITR陰性標(biāo)記分子CTLA-4結(jié)合 CD80/CD86CCR7介導(dǎo)Treg細(xì)胞的遷移F0XP3是Treg細(xì)胞發(fā)育成熟和發(fā)揮功能的必要因素；是目 刖Treg細(xì)胞最敏感的標(biāo)記CD127CD127是IL-7受體一部分，是，是新發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞標(biāo)記分子F0XP3 : FOX(forkhead box)是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，是一 個具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族，通常和細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。FOX家 族成員都有一個叉頭樣結(jié)構(gòu)域，能與DNA結(jié)合。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家 族中的成員，2001年由Brunkow等首次報道。研究

6、發(fā)現(xiàn)，它的表達(dá)及功能與 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，TR細(xì)胞)密切相關(guān)。如果FOXP3基因發(fā)生突 變，將影響TR細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致IPEX綜合征(immune dysregulation， polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome)。FOXP3主要表達(dá)于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性 表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，而不表達(dá)于CD8+T細(xì)胞。在人類FOXP3不僅可 表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，還可表達(dá)于CD8+CD28-T細(xì)胞。但在CD4+T細(xì) 胞中的表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞。目前，F(xiàn)ox

7、p3(forkhead box P3，Scurfin) 是目前公認(rèn)的Treg細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。CD127 :最近發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)CD4，CD25和傳導(dǎo)信號FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞時，在一類特殊的細(xì)胞群體時會出現(xiàn)問題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體(CD127) 在外周血CD4+T的一個亞群中會下調(diào)表達(dá)。我們證實(shí)這些細(xì)胞FoxP3陽性， 且這群細(xì)胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)合使用CD4，CD25和CD127可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，比以前的通過其他標(biāo)志物來區(qū)分方法顯 著提高。這些細(xì)胞在功能抑制實(shí)驗(yàn)中可發(fā)揮高度抑制功能。實(shí)際上，通過CD4 和CD127表達(dá)來區(qū)分的細(xì)胞數(shù)量(包括CD25+CD

8、4+和CD25-CD4+ )三倍于 通過CD4+CD25hi區(qū)分的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。最后，我們使用CD127定量檢 測I型糖尿病病人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)CD127可作為人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志物。4、F0XP3流式檢測方法美國eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測抗體的公司之一，公司 通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化，建立了一套完美的針對FOXP3流式檢測特殊的試劑和方 案。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)設(shè)備1）流式上樣管 2）混勻振蕩器 3）離心機(jī)4）移液器、Tips5）流式細(xì)胞儀所需試劑1）細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑（CD4、CD25或CD8等）2）FOXP3熒光標(biāo)記抗體3）溶血素：（eBioscience

9、目錄號00-4333 ）用于裂解紅細(xì)胞4）淋巴細(xì)胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個核細(xì)胞后 再做后續(xù)檢測5）固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專用試劑，目錄號為00-5521或 00-5523 ;在 FOXP3 染色前，將其中的 Fixation/PermeabilizationConcentrate 和 Fixation/Permeabilization Diluent 以 1 : 3 的比例混合，配制好的溶液保存時間不要超過一天)其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer ( 00-4222 )或 PBS ,Permeab

10、ilization Buffer( Cat.No 00-8333 )等實(shí)驗(yàn)操作步驟注：對于不同的FOXP3克隆號抗體，在操作上可能存在著一些細(xì)微的差別。具 體實(shí)驗(yàn)時，請參考相應(yīng)的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人Foxp3 （clone PCH101, ca t. XX-4776）.為例。1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上 清。斡旋分散細(xì)胞。3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或 四度避光孵育30-60min （小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。4、每管加 2ml Ixpermeabilization buffer。5、300g室溫離心5min,棄上清。6、2ml Ixpermeabilization buffer重懸細(xì)胞。7、300g室溫離心5min,棄上清。&加 100ul Ixpermeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入二抗 FOXP3 （或 其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。9、2ml Ixpermeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心 5min,棄上清。10、加2ml流式染色液，300g室溫離心