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文檔簡介

1、克隆表達與引物設(shè)計動物醫(yī)學院專題討論Clone,Expression,and Prime Design克隆表達的路線目的DNA片段和載體的連接目的DNA片段和載體的制備連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化重組子篩選 目的蛋白的誘導表達目的蛋白的純化表達的目的載體的選擇引物的設(shè)計是關(guān)鍵什么是克??？目的基因的克隆及其原核表達技術(shù)路線RNA ExtractionVectorTVectorTPCR ProductAApET -HEHEHEVRT-PCR轉(zhuǎn)化DE3HE蛋白ITPG誘導大腸桿菌1. 明確實驗的目的，根據(jù)實驗目的設(shè)計引物。2. 選擇表達載體，根據(jù)載體的酶切位點，在引物的5端加入酶切位點。3. 分析所要擴增的基因片

2、段，對其保守性，抗原優(yōu)勢位點等進行分析。4. 利用軟件，參照引物設(shè)計的原則，進行引物的設(shè)計。實驗目的與引物設(shè)計PCR引物設(shè)計的目的： 找到一對合適的核苷酸片段，使其能夠有效的擴增模板DNA。引物設(shè)計目的和PCR擴增引物常用PCR擴增的體系（25L）和條件程序：95 變性5min；94 變性30s，52 退火30s，72延伸40s，30 個循環(huán)；72延伸10min ddH2O17L10buffer2.5LdNTP1L上游引物1L下游引物1L模板2LTaq 酶0.5L3355Sense primerAntisense primer引物設(shè)計的原則1. 引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。2. 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)；避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)。自由能G58.6l kJ/mol。3. 引物長度一般在1530堿基之間。4. G+C含量在40%60%之間。5. 堿基要隨機分布。6. 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補；引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 7

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