氨基酸的分離鑒定-紙層析法

1、氨基酸的分離鑒定紙層析法化學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：氨基酸的分離鑒定紙層析法實(shí)驗(yàn)室名：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2012-11-15任課老師：楊艷專業(yè)班級(jí)：生物工程1142學(xué)生姓名：髙曄學(xué) 號(hào)：201121030219組別：第五組【實(shí)驗(yàn)器材】器材層析缸、毛細(xì)管、小燒杯 、量筒、培養(yǎng)皿 、分液漏斗、層析濾紙 (新華一號(hào) )、噴霧器（或白瓷盤），烘箱（或吹風(fēng)機(jī)）、鉛筆、直尺試劑1)、擴(kuò)展劑40mL將 20 mL 水飽和的正丁醇和 5 mL 醋酸以體積比4：1 在分液漏斗中進(jìn)行混合。然后與15mL 蒸餾水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)

2、展劑約 5mL 置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2)、氨基酸溶液 05的賴氨酸、 脯氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液 (各組份濃度均為 05 )各配置 5mL 。3)、顯色劑 50100mL 01水合茚三酮正丁醇溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1）檢查培養(yǎng)皿是否干燥、 潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi) 120烘干。2）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約 5mL 展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來(lái)，平衡 20min 。3）規(guī)劃：帶上手套，取寬約 10cm、高約 15cm 的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣 23 cm處輕輕用

3、鉛筆劃一條平行于底邊的直線 A ，在直線上做 4 個(gè)記號(hào)，記號(hào)之間間隔 2cm，這就是原點(diǎn)的位置。另在距左邊緣 1cm 處畫一條平行于左邊緣的直線 B，在 B 線上以 A、B 兩線的交點(diǎn)為原點(diǎn)標(biāo)明刻度（以厘米為單位） ，參見(jiàn)下圖。圖 2 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖4） 點(diǎn)樣：用毛細(xì)管分別取 10mL 左右的氨基酸樣品點(diǎn)在四個(gè)位置上。干后重復(fù)點(diǎn)樣，同一位置上需點(diǎn) 23 次， 23mL/ 次，保證每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過(guò) 3mm 。其中 3 個(gè)是已知樣， 1 個(gè)是待測(cè)樣品。5） 層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要保持平行，參見(jiàn)圖 1-1。向培養(yǎng)皿中加入擴(kuò)展劑，使其液面高度達(dá)到1cm

4、左右，將點(diǎn)好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面在 A 線下約1cm），罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)擴(kuò)展劑上升到 A 線時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔一定時(shí)間測(cè)定一下擴(kuò)展劑上升的高度，填入表 1 中。當(dāng)上升到 15 18cm，取出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，自然風(fēng)干或用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。6） 顯色：用噴霧器在通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上均勻噴上 0.1% 茚三酮正丁醇溶液， 然后置烘箱中烘烤 5 分鐘 (100)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。7） 計(jì)算各種氨基酸的 Rf 值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見(jiàn)表2。8） 以層析時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)展劑上

5、升高度為縱坐標(biāo)畫圖，求出擴(kuò)展劑上升到 15cm 時(shí)所需要的時(shí)間?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理】X表 1擴(kuò)展劑前沿上升速度0510 15 20 30 40 6090 （min）Y0.1.2.3.4.5.7.8.1（cm08515 75 859988. 5）表 2 各種氨基酸的 Rf 值賴氨 脯氨亮氨 待測(cè)酸酸酸氨基0.10.430.7酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中100.44心的距離0.80.880.80.88原點(diǎn)到溶劑前沿的88距離0.10.480.70.50Rf29判斷待測(cè)氨基酸賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以知道每種氨基酸的在擴(kuò)展劑中的移動(dòng)速率是不相同的，利用每種氨基酸在紙上的位置不同可以計(jì)算出

6、氨基酸的Rf 值。和標(biāo)準(zhǔn)的 Rf 值對(duì)比，得出氨基酸種類。據(jù)此由上表 2 可知，混合氨基酸是由賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸組成?！咀⒁馐马?xiàng) 】.點(diǎn)樣時(shí)要避免手指或唾液等污染濾紙有效面 (即展層時(shí)樣品可能達(dá)到的部分 )。.點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大，防止層析后氨基酸斑點(diǎn)過(guò)度擴(kuò)散和重疊，且點(diǎn)樣后吹風(fēng)溫度不宜過(guò)高，以免樣品變性 (斑點(diǎn)發(fā)黃 )。.展層開始時(shí)切勿使樣品點(diǎn)浸入溶劑中。.展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。.如果樣品中溶質(zhì)種類較多，且某些溶質(zhì)在某一溶劑系統(tǒng)中的 Rf 值十分接近時(shí)， 單向?qū)游龇蛛x效果不佳，則可采用雙向?qū)游觯磳悠伏c(diǎn)在一方形濾紙的角上，先用一種溶劑系統(tǒng)展層。濾紙取出干燥后，再將濾紙轉(zhuǎn) 90 度角，用另一溶劑系統(tǒng)展層。所得圖譜分別與這兩種溶劑系統(tǒng)中作的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)層析圖譜