生物安全管理體系文件

1、試驗(yàn)室生物安全治理制度治理制度。一、人員準(zhǔn)入條件1、試驗(yàn)室人員、關(guān)心人員和外來人員必需具備相應(yīng)的專業(yè)技能、受過相關(guān)的試驗(yàn)可進(jìn)入相應(yīng)的試驗(yàn)室工作。感染后果嚴(yán)峻的額人員也不得進(jìn)入試驗(yàn)室。3、試驗(yàn)室人員必需在身體狀況良好、穿戴好防護(hù)服白外套的狀況下，方能感染狀態(tài)或呈重度疲乏狀態(tài)時不得進(jìn)入。二、生物安全日常治理：(一)生物安全行為標(biāo)準(zhǔn)飾物。白外套。全防護(hù)用品，如安全鏡、面罩或護(hù)目鏡。皮膚受損時應(yīng)以防水敷料掩蓋。護(hù)目鏡，面罩帶護(hù)目鏡的面罩或其它防護(hù)用品。的任何地方貯存人用食品及飲料。放在有規(guī)定禁放的和可能發(fā)生污染的區(qū)域。(二)操作準(zhǔn)則染時應(yīng)脫掉手套，馬上洗凈雙手，再換一雙手套。2、當(dāng)試驗(yàn)過程可能涉及到直

2、接或意外接觸到血液、有傳染性的材料或被感染的體液或其他污染材料后，即使戴有手套也應(yīng)馬上洗手。套離開試驗(yàn)室或在試驗(yàn)室來回走動。里。制止舔標(biāo)簽。5、盡量用塑料制品代替玻璃制品，不使用裂開或有缺口的玻璃器具。破損的玻的玻璃器具和比例碎片應(yīng)丟棄在有特地標(biāo)記的、單獨(dú)的，不易刺破的容器里。6、全部的試驗(yàn)步驟都應(yīng)盡可能使氣溶膠或氣霧的形成把握在最小程度。任何使接排放。7、應(yīng)盡可能削減使用利器和盡量使用替代品。包括針頭、玻璃、一次性手術(shù)刀之二前置換。室負(fù)責(zé)人報告。此類事故的書面材料應(yīng)存檔。在從試驗(yàn)室中取走之前，應(yīng)以安全方式處理和處置，使其到達(dá)生物學(xué)安全。操作臺面、離心機(jī)、加樣槍、試管架必需擦拭、消毒。(三)監(jiān)

3、視與檢查1、涉及病原體的科室負(fù)責(zé)人要經(jīng)常對各項(xiàng)試驗(yàn)的生物安全性進(jìn)展檢查和監(jiān)視。并報告安全隱患大事。三、常見試驗(yàn)室廢棄品處理試驗(yàn)室廢棄品按物理類型而言可分為固體廢棄品、液體廢棄品及氣體廢等。分類特征常見廢棄物名稱處理程序感染性廢攜帶病原微生包括被感染性試驗(yàn)材料等污放入盛有適宜消毒液的不易碎棄物物具有引發(fā)感染性疾病傳播危急的廢棄物管等試驗(yàn)器材以及廢棄的感基等。裂的容器中浸泡。留意消毒劑的種類、濃度及浸泡時間，浸泡后放入適宜的容器內(nèi)進(jìn)展高壓滅菌或燃燒處理病理性廢試驗(yàn)動物尸體集中與試驗(yàn)室指定位置，嚴(yán)格棄物等廢棄物動物組織、尸體等。與感染性生物材料區(qū)分，高壓滅菌后廢棄。盛放容器宜浸泡消毒。損傷性廢能刺傷

4、或割傷高壓滅菌或燃燒處理，盛放銳棄物人體的銳器等廢棄物刀及裂開玻璃等器的一次性容器不易刺破，不宜將容器裝得過滿小于四分之三，如感染性廢棄物進(jìn)展高壓滅菌及燃燒處理化學(xué)性、具毒性、腐蝕強(qiáng)酸強(qiáng)堿等化學(xué)性物品須經(jīng)中放射性廢性、易燃易爆化學(xué)性廢棄物一級放射性廢和消退腐蝕行前方可廢棄，其棄物的化學(xué)性廢棄物及放射性廢棄物棄物等。他物品經(jīng)稀釋對環(huán)境與人體無毒后可廢棄。含有毒、有害化學(xué)物品的試驗(yàn)材料在使用后應(yīng)置于帶明顯危急標(biāo)志的容器內(nèi)送至指定地點(diǎn)統(tǒng)一處理。四、支持文件中華人民共和國傳染病防治法病原微生物試驗(yàn)室生物安全治理?xiàng)l例試驗(yàn)室生物安全通用要求(轉(zhuǎn)變 9489-2022)微生物和生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則

5、WS233-2022試驗(yàn)室生物安全守則WHO,第三版，2022病原微生物試驗(yàn)室生物安全生物安全培訓(xùn)衛(wèi)生部規(guī)劃教材，第 2 版醫(yī)療廢棄物治理?xiàng)l例試驗(yàn)室生物安全病毒制備質(zhì)量治理體系名目原始病毒的擴(kuò)增病毒制備程序腺病毒的收獲和純化病毒滴度測定病毒質(zhì)控細(xì)菌污染及檢測 基因檢測病毒活性檢測體外細(xì)胞殺傷復(fù)制力量檢測原始病毒的擴(kuò)增-病毒種子制備細(xì)胞，80%細(xì)胞處于對數(shù)生長期，T175 培育瓶中進(jìn)展：細(xì)胞計(jì)數(shù)：超凈工作臺。去除細(xì)胞培育瓶中的舊培育基。 10mlPBS 沖洗細(xì)胞后棄上清，12 次，以到達(dá)徹底洗掉培育基中的血清成份。1ml 0.25%胰酶消化液，使之鋪滿細(xì)胞外表，放入培育可終止消化。 終止消化：輕

6、拍培育瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，從無細(xì)胞面?zhèn)葏⒓舆m量完全培育基含血清的DMEM終止消化，并用移液管吸吹數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混合均勻，使之成為單細(xì)胞混合液。計(jì)數(shù)板預(yù)備：用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。 加樣：用移液管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液可酌情稀釋，計(jì)數(shù)板沖洗拭干重加樣。 計(jì)數(shù)：靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移，將細(xì)胞計(jì)度。16 個中方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的 4 ，對沉降在格的 4 ，對沉降在格線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml4 個大格細(xì)胞總數(shù)/410 000 稀

7、釋倍數(shù)感染種子：取平行比照培育優(yōu)質(zhì)融合度80%的細(xì)胞，棄舊培育基并L 感染培育基% ，輕輕晃動培育瓶，使病毒在培育基中充分混勻。72 條件下培育。 凍存于-80備用，并測定病毒滴度，以備感染病毒使用。大量病毒制備的滅菌預(yù)備工作500mL菌。 滅菌包布包被滅菌。，枯燥，滅菌包布包被滅菌。確保離心管實(shí)在一個大燒杯上，這樣漏液不會污染操作臺。菌。Beckman 超高速離心機(jī)及特制轉(zhuǎn)子和離心管預(yù)備。V96病毒制備程序一細(xì)胞預(yù)備：建立細(xì)胞種子庫：復(fù)蘇細(xì)胞CV1 用于痘苗病毒病毒；JH293 用于腺病毒病毒3/5/7/14 天取上清兩份，一份用于支原體檢測，另一份加至80%消化傳代擴(kuò)增并凍存足量細(xì)胞種子于

8、液氮中，凍存管上須準(zhǔn)確慢凍速溶細(xì)胞擴(kuò)增培育：當(dāng)1瓶T175培育瓶中細(xì)胞生長融合度80% 完全培育基終止消化， 6ml2ml 此混合液參加含 18ml 完全培育基%血清5 培育瓶中共三瓶連續(xù)培育1 3，原瓶連續(xù)培育待下一次傳代。 4%6 瓶為一批1 ，其中1 5 培育瓶中細(xì)胞作37CO248-72 80%。二病毒感染：80%時，預(yù)備進(jìn)展病毒感染；同時也觀看其它全部細(xì)胞，比照細(xì)胞增殖速度是否全都。取平行比照瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算需要感染病毒量1pfu/cell)。-80冰箱中取出測定過病毒滴度的病毒種子，按計(jì)算好的病毒量配制2%DMEM 37二氧化碳孵育48-72 小時，或直到90%CPE。痘苗病毒的

9、收獲和純化三病毒收獲：36 T175 培育瓶，輕輕晃收集500ml 離心瓶中。3500rpm，15min，4離心。棄上清，移液管取10mlPBS50ml心管中。 500ml 50ml離心管中。3500rpm，15min，4離心。棄上清，47ml 冷VV-Buffer-80待純化。四病毒純化：病毒顆粒完全釋放。60 次。 離心管中配平，1200rpm，5min ，4離心。吸取上清于另一 50ml 離心管中， 取 3ml VV-Buffer 重懸沉淀， 2ml50ml 60 次。 離心管中配平，1200rpm，5min ，4離心。裂開 20s。在 SW41Beck man 離心機(jī)專用離心管中參加

10、7ml 36%蔗糖w/v)10MM-lH0l 研磨超聲處理過的病毒液，使之形成分層。VV-Bufferg誤差越小越好k離心機(jī)中14 / 25 / 36 轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平13500rpm/32900 xg，80min，4。6mlVV-Buffer 重懸沉淀。梯度蔗糖：% 蔗糖溶液 (10mMTris-HCLpH9.0 配制)，依次向上分別為% % % 蔗糖溶液最上層。每個病毒樣本制備至少兩份梯度，分別留神在上層參加病毒懸液，使之形成分層。M-H0稱重配平，誤差須小于誤差越小越好，移kn4/5/6轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平0m4。2mlVV-Buffer 重懸沉淀。EP 管，取少量病毒液進(jìn)展滴度測定，其余依據(jù)試驗(yàn)

11、/100ul/ 支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝凍存于-80冰箱病毒庫。腺病毒的收獲和純化三.病毒收獲：36 T175 培育瓶，輕輕晃收集500ml 離心瓶中。2022rpm，10min，4離心。棄上清，移液管取10mlPBS50ml心管中。PBS5ml 500ml 離心瓶，并將液體轉(zhuǎn)致同 離心管中。1000rpm，10min，4離心。 -80待純化。四病毒純化：37水浴中反復(fù)凍融三次。50ml 離心管中，室溫，6000 rpm 10-80CsCI 梯度離心。 10ml1.25g/mlCsCI.再留神輕輕參加, CsCI 液面上。 LE-80K 14/ 25/36 轉(zhuǎn)子對應(yīng)配

12、平離心，25000rpm，15，2 小時。19 號針頭刺入離心管，留神抽取夾層膜狀物病毒條帶呈乳白色50ml 離心管中。將 50ml離心管中含病毒液體順液面輕輕平均安排參加至已參加 5ml 超高速離心用離心管中。 LE-80K 14/ 25/36 轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平離心，40000rpm，15，15 小時。19 號針頭50ml 離心管中。24 小時。病毒分裝與儲存：透析完畢后，將透析袋轉(zhuǎn)至無菌工作臺中，取少量病毒20ul/50ul/100ul/支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝儲存于-80冰箱病毒庫。病毒滴度測定TCID50CV-1VVJH293AD細(xì)胞。當(dāng)培育瓶中細(xì)胞生長率80%

13、5mL10FBS DMEM 培育基混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)。6 303 0 FBS DMEM，過夜。1：105 稀釋：10ul 10ul 病毒原液990ulDMEM3ul 混合液2997ul 3ul 混合液2997ul DMEM20ul 96 孔板第一排 5 次，去掉槍頭；22 5 次; 5 次；依次到倒數(shù)其次排，最終一排做比照。810 天觀看。先觀看最終一排細(xì)胞狀態(tài)，長滿時，CPE 的數(shù)值。計(jì)算病毒滴度。DilutionsNo.DilutionsNo. infectedwellsNo.un-infectedwellsTotal no.infectedinfected% totalinfectedAbo

14、ve0.5%above0.5%below 0.5log diluabove51.00E-051206901TRUE0001.00E-061205701TRUE0001.00E-071204501TRUE0001.00E-081113310.9705882TRUE0001.00E-091022230.88TRUE0001.00E-105712100.5454545TRUE0.54545450-101.00E-11757150.3181818FALSE00.31818180#ofWells12mls/well0.020.50.54545450.3181818-10Prop.Dist.0.2Log-

15、10.2TCID50TCID506.3096E-111/TCID501.5849E+10TCID50/ml7.9245E+11pfu/ml5.4679E+11cellnumbervolumenumbervolumepfu/cell90000212150848一、細(xì)菌污染及檢測； 三、基因檢測；四、病毒活性檢測；五、體外細(xì)胞殺傷復(fù)制力量檢測。一、細(xì)菌污染及檢測：背景介紹：細(xì)菌是一種元和細(xì)胞微生物，其大小以微米計(jì)。格外必要。試驗(yàn)步驟：10ul 4ml 的培育基 37，1800rpm 的搖床上搖過夜12-16h,假設(shè)有細(xì)菌污染，16h 內(nèi)就可獲得陽性結(jié)果。結(jié)果判讀：細(xì)菌污染。假設(shè)無，則判讀為陰性。二

16、、支原體污染及檢測：背景介紹：支原體是一種介于細(xì)胞和病毒之間、能獨(dú)立生活的最小微生物，最小的直徑1%可通過濾菌器，無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨子密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。期試驗(yàn)產(chǎn)生潛在影響，所以對支原體的污染必需嚴(yán)加防范。DNA PCR PCR 檢測法。試驗(yàn)步驟：1 試驗(yàn)前預(yù)備： 樣本和比照預(yù)備：5ul 495ul 細(xì)胞培育確定無污染100 倍稀釋。50ul 一支做陽性比照。陰性比照：滅菌蒸餾水。 引物的預(yù)備：Fwd-1.： ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT A Fwd-2.：CCTAAAGGAATTGACGGGAACCCGRev.：TGCACCAT

17、CTGTCACTCTGTTAACCTC14 種不同支原體。50pmol/ul50ul/管，20保存，待使用。2PCR反響：配置全過程需在冰上操作：1st band at 720bpPCR反響液：滅菌蒸餾水upto 20ul10*PCR Buffer2ulDntp(2.5mM)1.6ulMgCl2(25mM)Fwd-1.1.2ulMIX1ulRev.1ulTaq 酶0.3ul樣本/比照1ul1st反響條件95x30s95x3095x30s56 x30s72x 1min72 x 1minPCRPCR145bpPCR鑒定。2ndRound Band at 145bpPCR反響液：滅菌蒸餾水upto

18、20ul10*PCR Buffer2ulDntp(2.5mM)1.6ulMgCl2(25mM)Fwd-2.1.2ulMIX1ulRev.1ulTaq 酶0.3ul第一輪PCR對應(yīng)樣本/比照1ul模板，第一輪產(chǎn)物可加1ul放置4冰箱。待跑瓊脂電泳膠。2nd反響條件與第一輪一樣95x30s95 x30 s56 x30 s72 x 1min72 x1min35 cycles輪產(chǎn)物加1ul10*lodingbuffer ，終止反響，跑瓊脂電泳膠。3瓊脂電泳跑膠： 配置 1%的瓊脂糖凝膠即可。首先將錐形瓶洗干凈，然后依據(jù)樣本量和膠的大小取肯定量的電泳緩沖液煮好的凝膠需無氣泡、色澤及質(zhì)地均勻。50左右時，

19、參加相應(yīng)EB,膠倒入裝好的干凈模具中。待凝膠完全凝固30min后， 垂直方向拔梳子。此時，凝膠需平坦、不漏孔，可以用于電泳檢測。膠前預(yù)備：槽正中心。留意：放凝膠前，需將膠托底部的凝膠抹干凈，防止膠托在電泳槽中滑動；此時，可順便觀看凝膠是否漏孔。留意保持桌面衛(wèi)生，防止緩沖液灑到桌。 上樣： 挨次應(yīng)與電泳槽上的標(biāo)記全都。留意:合后，輕甩，依據(jù)規(guī)定的挨次上樣，上樣在電泳槽旁邊，用于核查；點(diǎn)樣時不戳孔、不外漏、不溢出；樣品完全沉到底部后，再固定凝膠.樣品上完后，加陽性比照，陰性比照。 bp) ,5ul. 跑電泳：留意：確認(rèn)電極正確連接100400mA star 鍵開頭電泳。 凝膠成像： PE 手套上留

20、意B 染液甩干入凝膠成像系統(tǒng)中，依據(jù)“Tanon留意EB EB 鼠標(biāo)，最終保存膠圖信息至規(guī)定的文件夾內(nèi)，命名規(guī)章為：日期+姓名+工號部門+電泳銅人陣考核。留意事項(xiàng)務(wù)必留神，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。PE 手套和口罩。三基因檢測： 基因組測序試驗(yàn)一、目的 序列信息二、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmp DNA blood minikitQIAGEN51104室溫KTIANGEN040204 度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計(jì)ThermoNANODROPONE恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶

21、玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2四、試驗(yàn)過程病毒基因組提取200ulBioTTT001 10ul 蛋白酶K，混勻。 56 度水浴鍋內(nèi)，孵10 分鐘。 15s 1 2ml 離心管中。 3 分鐘。1 1.5ml 離心管中。50ul 1 分鐘，14000 1 分鐘濃度測定2ul 超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)展校準(zhǔn)。抬起測量臂，擦拭殘留液體。1ul 待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。送華大基因測序80ng/ul 的樣品，進(jìn)展測序。華大基因進(jìn)展樣品檢測，并出示檢測報告。樣品檢測合格后，建立樣品庫進(jìn)展測序。數(shù)據(jù)分析。 SOP一、目的 的構(gòu)

22、建二、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmp DNA blood minikitQIAGEN51104室溫KTIANGEN040204 度EcoR VNEBR1095S-20度Buffer 3.1NEBB7203S-20度瓊脂糖Invitrogen75510-019室溫DNAMarkerTIANGEN100bp4 度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計(jì)ThermoNANODROPONE恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶 玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2瓊脂糖

23、凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗(yàn)過程病毒基因組提取200ulBioTTT001 10ul 蛋白酶K，混勻。 56 度水浴鍋內(nèi)，孵10 分鐘。 15s 1 2ml 離心管中。 3 分鐘。1 1.5ml 離心管中。50ul 1 分鐘，14000 1 分鐘濃度測定2ul 超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)展校準(zhǔn)。抬起測量臂，擦拭殘留液體。1ul 待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。酶切配制酶切體系基因組基因組EcoR V Buffer 3.1超純水總體積40ul約500ng)1ul 5ul 4ul50ul37 16-18 小時。電泳 25-30 分鐘

24、，成像觀看。 PCR IL-12PCR SOP一、目的 的構(gòu)建二、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmp DNA bloodkitminiQIAGEN51104室溫KTIANGEN040204 度2MixVazyme102151-20度引物詳見附注DNAMarkerTIANGEN100bp4 度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計(jì)ThermoNANODROPONE恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶 玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2PCR 儀Life tech

25、nologies2720 Thermal cycler瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗(yàn)過程病毒基因組提取200ulBioTTT001 10ul 蛋白酶K，混勻。 56 度水浴鍋內(nèi)，孵10 分鐘。 15s 1 2ml 離心管中。 3 分鐘。1 1.5ml 離心管中。50ul 1 分鐘，14000 1 分鐘濃度測定2ul 超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)展校準(zhǔn)。抬起測量臂，擦拭殘留液體。1ul 待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。PCRPCR 體系：基因組0.5ul2Mix2ulPrimer-F1ulPrimer-R1ul超純水16.5ul

26、總體積20ulPCR 儀進(jìn)展擴(kuò)增,反響體系如下：94949455727245min30s 30s 40s 5min+電泳 25-30 分鐘，成像觀看。附注：引物信息95 forward8 對 E3-gp19k 上游3 reverse11 nsIL12 下游105 forward11 nsIL12上游3 reverse8 對 E3-gp19k 下游115 forwardATGatatgggaactgaagaaag3 reverseTTAGGAAGCATTCAGATAG92871530109E3-gp19k+nsIL121394102853429135nsIL12+E3-gp19k60111112

27、853430109nsIL121575 IL-12 SOP(ELISA)一、目的 IL12 的表達(dá)水平二、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194 度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)Gibco10378-016-20度Human IL12 ELISA KITeBioscien88-7126-88Human IL12 ELISA KITeBioscien88-7126-884 度ce儀器品牌型號生物安全柜Therm

28、o1300SERIESA2細(xì)胞培育箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800 SERIES水浴鍋晶 玻SS-H2酶標(biāo)儀BECKMANDTX880四、試驗(yàn)過程細(xì)胞培育及鋪板 80-90%時進(jìn)展傳代。3-5 次，觀看細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)。S-M 00l孔進(jìn)展鋪板。將六孔板放置于細(xì)胞培育箱中，過夜培育。病毒感染 3 個孔，分別進(jìn)展計(jì)數(shù)，取平均值。 2ml DMEM。 培育基,放置于細(xì)胞培育箱中進(jìn)展培育。樣品收集及凍融 200ul 吸點(diǎn)收集三個復(fù)孔。樣品保存于超低溫冰箱中。37 度水浴鍋中進(jìn)展解凍。3-5 37 度水浴至完全溶解。3

29、 次。IL12 表達(dá)的檢測相關(guān)試劑預(yù)備試劑試劑1 X ELISA Diluent1 X Coating Buffer1 X Capture Antibody1XDetectionAntibody1X Avidin-HRP1 XTMBStop SolutionWash Buffer稀釋10ml 5X Diluent 40ml 超純水中12ml 10X Coating Buffer108ml 超純水中48ul 250X Capture Antibody 加到 12ml 1 X CoatingBuffer中 Antibody 12ml 1 X ELISADiluent 中 12ml 1 X ELIS

30、A Diluent中Working Concentration2N H2SO41 XPBS,0.05%Tween-20包被 ELISA 96 孔板每孔中參加100ul 1 X鮮膜包裹后放入4 度冰箱中，過夜。洗板吸走孔中液體，清洗3 次，每次每孔參加250ul Wash Buffer，輕輕晃動板子1 分鐘，吸走清洗液，吸水紙吸干剩余液體；封閉 Diluent，室溫放置1 小時。 12ml 1 X ELISA Diluent 中，得到濃度為500pg/ml8 個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，一3 個復(fù)孔。50025012562.531.7515.8757.93753.96875pg/mlpg/mlpg/ml

31、pg/mlpg/mlpg/mlpg/mlpg/ml10ul+12500l500l500l500l500l500l500lmlDiluentDiluentDiluentDiluentDiluentDiluentDiluentDiluent500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul1XAt 可預(yù)先摸索稀釋倍數(shù)，100ul/3 個復(fù)孔；4 度過夜孵育。4.7 洗板 同 4.33-5 次。孵育檢測抗體 每孔參加 Antibody1 小時；同 3-5 次。100ul1XAvidin-HRP30 m, 4.3 洗 100ul 1 X TMB15 分鐘后，每孔參加Sol

32、ution。讀板 吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品IL12 表達(dá)量。四病毒活性檢測： 一、目的 二、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194 度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)Gibco10378-016-20度1%solutioncrystalvioletSigmaV5265室溫三、儀器設(shè)備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIESA2細(xì)胞培育箱Ther

33、mo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800 SERIES四、試驗(yàn)過程細(xì)胞培育及鋪板 80-90%時進(jìn)展傳代。3-5 次，觀看細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)。 1.0 X105/ml，500ul/孔進(jìn)展鋪板。24 孔板放置于細(xì)胞培育箱中，過夜培育。病毒感染 3 個孔，分別進(jìn)展計(jì)數(shù)，取平均值。 DMEM 培育基稀釋500ul DMEM；鋪板如下：DoseBioTTT001比照病毒dl1520104VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2103VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2102VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2101VP/cell復(fù)孔1復(fù)

34、孔2復(fù)孔1復(fù)孔2100VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2Mock復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔3復(fù)孔4病毒梯度稀釋：11150ul150ul150ul150ul111111110Total 2022ul1350ul1350ul1350ul1350ul2022ul無血清DMEM2 小時，吸走含病毒培育基，500ul/PBS 輕輕晃動清洗一次。 培育基,5 天;結(jié)晶紫染色PBS 洗一遍。4%30 分鐘。500ul/PBS 洗一遍。20ul 結(jié)晶紫溶液，晃動板子，至孔底完全浸染結(jié)晶紫。 分鐘，1ml/PBS 洗兩遍。五體外細(xì)胞殺傷復(fù)制力量檢測： SOP一、目的 對靶細(xì)胞的殺傷力量二、試劑來源、配制及保存條件試

35、劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194 度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)Gibco10378-016-20度MTSPROGEMAG111-20度PMS-20度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIESA2細(xì)胞培育箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800 SERIES酶標(biāo)儀BECKMANDTX880四、試驗(yàn)過程細(xì)胞培育及鋪板C時進(jìn)展傳代。80-90%3-5 次，觀看細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞

36、，制備單細(xì)胞懸液。利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)。S-M 0l/孔進(jìn)展鋪板104/孔。鋪板方式如下(PBS100ul/孔，2%Medium90ul/孔)：PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS2%McellscellcellcellcellcellcellcellcellcellPBSsssssssss2%McellscellcellcellcellcellcellcellcellcellPBSsssssssss2%McellscellcellcellcellcellcellcellcellcellPBSsssssssss2%Mcellscellcellcellc

37、ellcellcellcellcellcellPBSsssssssss2%McellscellcellcellcellcellcellcellcellcellPBSsssssssss2%McellscellcellcellcellcellcellcellcellcellPBSsssssssssPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS96 孔板放置于細(xì)胞培育箱中，過夜培育。病毒感染 小時，觀看細(xì)胞完全貼壁。BioTTT001，最高感染劑量為10000PFU/cell，使用2%FBS-DMEM 培育基10ul 2%FBS-DMEM；40ul40ul40ul40ul40ul40ul40ul40ul40ul40ul10410310210110-11