核酸含量測定定磷法

1、核酸含量測定定磷法1第1頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四核酸定量測定常見的方法1. 定磷法：將核酸消化，測定其無機磷量，由此計算出核酸含量，反應(yīng)靈敏。2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm處有吸收高峰，操作簡便，受蛋白質(zhì)和核苷酸的干擾影響。3. 地衣酚法：用于測定RNA的含量，RNA與濃鹽酸共熱，降解形成的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡玫匾路臃磻?yīng)來測定，特異性差，戊糖均有此反應(yīng)。4. 二苯胺法：DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉(zhuǎn)化為-羥-酮基戊醛，利用二苯胺試劑反應(yīng)，除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應(yīng)。2第2頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四定磷法的原理

2、首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷，利用定磷試劑測定無機磷量。反應(yīng)式為： (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3（鉬藍）Vit C3第3頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四 還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無機磷含量在125g 范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量為9.5%，即1g RNA磷相當于10.5 g RNA。DNA的含磷量平均為9.9%。4第4頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四試

3、劑酵母RNA樣品溶液：2000g/mL標準磷原液：含磷量為1000 g/mL標準磷溶液：含磷量為10 g/mL，每組用干試管取15mL定磷試劑：含硫酸、鉬酸銨、Vit.C，淺黃色，如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL5第5頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四實驗步驟1. 核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷；2. 制定定磷標準曲線；3. 測定回收率和樣品總磷量。6第6頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四1. 樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/mL010標準磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/L H2SO4/m

4、L222消煮爐中消化26h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻7第7頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四2. 定磷標準曲線的制定（每人做一份） 每人取18支試管，按照下表平行操作： 12 3456標準磷溶液/mL 00.10.20.30.40.5dH2O/mL 1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 用漩渦混合器混勻，45恒溫水浴保溫25分鐘 用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A(chǔ)660(1) A660(2) A660平均值 A6

5、60平均值空白 08第8頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四 3. 測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）8（樣品）9（標準）定容溶液/mL 1.51.50.15dH2O/mL 001.35定磷試劑/mL 1.5 1.5 1.5 用漩渦混合器混勻，45恒溫水浴保溫25分鐘 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值空白 09第9頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四數(shù)據(jù)處理關(guān)于空白： 16號管用于繪制定磷標準曲線，1號管作為空白。 79號管用于樣品及回收率的測定，7號管作為空白。 以每管含磷量(g)為橫坐標，吸光值為縱坐標畫標準曲

6、線，直線應(yīng)過原點。 在標準曲線上查出樣品(x)和標準磷(y)的含磷量(g)。10第10頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四計算回收率： (2) 計算樣品總磷量： (3) 計算RNA量： (4) 樣品RNA含量：11第11頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四操作注意事項1. 每人獨立操作，不允許兩人穿插取樣；2. 要求試劑及所有器皿清潔，不含磷；3. 每管加樣和測定均要求平行操作；4. 消化溶液定容后務(wù)必上下顛倒混勻后再取樣；5. 各種試劑必須用移液管按順序準確量取，移液管口用吸水紙擦凈，溶液盡量加到試管下部，標準溶液要求用差量法。6. 漩渦混合器的使用：用點動檔，試管豎直或稍傾斜垂直向下用力。7. 測定吸光值時，用一個比色杯裝去離子水調(diào)節(jié)分光光度計零點，另一個比色杯按照從低濃度到高濃度的順序測定，不用潤洗，切忌甩比色杯，將藍色溶液撒在儀器和地面上。 12第12頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分，星期四思考題1. 回收率的意義；2. 實驗所用的水質(zhì)、試劑質(zhì)量、定磷試劑的酸度對測定結(jié)果的影響。13第13頁，共14頁，2022年，5月20日，5點27分