毛細(xì)管電泳精品課件

1、毛細(xì)管電泳第1頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.10.1 概述1. 電泳：在外加電場的影響下，帶電的膠體粒子或離子在介質(zhì)中作定向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。2.不同帶電粒子的電荷量和分子大小不同，流動(dòng)速率也不同，因此電泳是一種適用于膠體粒子和離子的分析分離技術(shù)。第2頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Ress進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免

2、疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。第3頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。 電泳的分類第4頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)

3、，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。第5頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分

4、蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)第6頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、 板電泳、柱電泳。 據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量、免疫電泳。第7頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四電泳技術(shù)的特點(diǎn)凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離,并可進(jìn)行定性或定量分析;樣品用量極少;設(shè)備簡單;可在常溫進(jìn)行;操作簡便省時(shí);分辨率高;特別適合于蛋白、核酸等大分子物質(zhì)的分離。是生化藥物、基因工

5、程藥物分析的重要手段。第8頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四毛細(xì)管電泳（CE）毛細(xì)管電泳（CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE）或毛細(xì)管電分離法（CESM），是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液體分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳實(shí)際上包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入到納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析稱為可能。第9頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四高效毛細(xì)管電泳（HPCE）高效毛細(xì)管電泳（HPCE）是近年來發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)

6、和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。HPCE已成為一種重要的分離分析方法，在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。第10頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.10.2 高效毛細(xì)管電泳的理論基礎(chǔ)1.經(jīng)典電泳與高效毛細(xì)管電泳區(qū)別（1） 經(jīng)典電泳分離法的不足所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。（2） 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電

7、壓升高，電場推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。第11頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四2.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳：在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳。電滲流（electro osmotic flow，EOF）：指管內(nèi)溶液在外力電場作用下整體向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。第12頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四HPCE通常采用的是石英毛細(xì)管柱，一般情況下（pH3），硅醇基（SiOH）電離為硅氧基負(fù)離子（S

8、iO），使管壁表面帶負(fù)電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當(dāng)在毛細(xì)管兩端加高電壓時(shí)，雙電層中的陽離子向陰極移動(dòng)，由于離子是溶劑化的，所以帶動(dòng)了毛細(xì)管中溶液整體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在不少情況下，電滲流的速度是電泳流速度的57倍。第13頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3. 分離過程 電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。 帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，電滲流 電泳

9、時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。第14頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，因此最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其移動(dòng)速度相當(dāng)于電滲流速度；而負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，因而各種粒子因差速遷移而分離。分離方式的優(yōu)點(diǎn)：所有正負(fù)離子和中性分子都向同一個(gè)方向遷移，因此可在柱末端放置檢測器實(shí)現(xiàn)在線檢測。第15頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四4. 分離方程粒子的

10、電泳速率由下式?jīng)Q定：其中E為電場強(qiáng)度，ep為兩溶質(zhì)的平均電泳淌度，即離子在給定介質(zhì)中單位時(shí)間和單位場強(qiáng)下移動(dòng)的距離，淌度的大小與粒子的凈電荷、半徑及介質(zhì)黏度等相關(guān)。第16頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四溶液中同時(shí)存在泳流和滲流，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)速度應(yīng)當(dāng)是電泳流速度（ ）和電滲流速度（ ）的矢量和，即 式中，eo為電滲淌度，V為外加電壓，L為毛細(xì)管總長度。第17頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四理論塔板數(shù)n為：式中D為擴(kuò)散系數(shù)，分離度R為1，2分別為相鄰兩溶質(zhì)的電泳淌度，ep為兩溶質(zhì)的平均電泳淌度。第18頁，

11、共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四在HPCE中電滲流的一個(gè)重要特點(diǎn)是具有平面流型，電滲的驅(qū)動(dòng)力沿毛細(xì)管均勻分布，它使整個(gè)流體象一個(gè)塞子一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)。而在HPLC中流體流型則是拋物線型的層流，其中心處速度是平均速度的2倍。電滲流的平面流型和HPLC中高壓泵驅(qū)動(dòng)所產(chǎn)生的拋物線型層流的速度曲線不同，不會直接引起樣品組分區(qū)帶在柱內(nèi)擴(kuò)張，這是HPCE獲得高效分離的重要原因之一。第19頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四5. HPCE的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1. 高靈敏度：采用電化學(xué)檢測器，最低檢測限可達(dá)10-19 mol；2. 高效：HPCE每米理論塔板數(shù)為幾十

12、萬，高者可達(dá)幾百萬甚至幾千萬；3. 高速：通常的分析時(shí)間不超過30 min。有1.7 min內(nèi)分離19種陽離子及3 min內(nèi)分離30種陰離子的報(bào)道；4. 樣品用量少：只需nL（109 L）級；5. 低消耗：每次分析只需少量（幾毫升）流動(dòng)相，分析過程是在價(jià)格低廉的毛細(xì)管柱中進(jìn)行；6. 應(yīng)用范圍廣：從簡單的無機(jī)離子、有機(jī)離子到整個(gè)細(xì)胞，都可進(jìn)行分離分析。具有“萬能”分析功能或潛力。不足之處：進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對較窄。分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動(dòng)方向相反，出峰時(shí)間較長。第20頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四6. 影響柱效的

13、因素及改進(jìn)方法熱效應(yīng)：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑。則可以改變電滲流的方向。第21頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.10.3 高效毛細(xì)管電泳儀器 電壓：030KV。 分離柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器（可檢測到：10-1910-21 mol/L）第

14、22頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四毛細(xì)管的特點(diǎn)第23頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四檢測器由于HPCE采用了極小內(nèi)徑的毛細(xì)管，進(jìn)樣量很小，因此只有具有高靈敏度的檢測器，才能進(jìn)行定性、定量分析。檢測器是HPCE儀的關(guān)鍵部件。HPCE檢測器中應(yīng)用較廣泛的是紫外-可見檢測器和電化學(xué)檢測器。迄今為止，除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP）及紅外光譜未用于HPCE外，熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光類和其他類型檢測器（如折射率檢測器、同位素檢測器等）均已應(yīng)用。第24頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.10.4 高效毛細(xì)

15、管電泳的分離模式1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)2. 毛細(xì)管凝膠電泳(CZE)3. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC）4. 毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)5. 毛細(xì)管等速電泳（CITP）6. 毛細(xì)管電滲色譜第25頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳capillary zone electrophoresis ，CZE 帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反；電滲流 電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不

16、但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式；第26頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四2. 毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。 特點(diǎn)：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺

17、。柱便宜、易制備。第27頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。3. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在電場力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。第28頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)； 5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。 3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組

18、分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長； 4.可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；第29頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 1. 根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（68V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；4. 毛細(xì)管等電聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF第30頁，共

19、44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 4. 聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離； 5. 陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6. 加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測； 7. 電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。第31頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。 2. 負(fù)離子分析時(shí)，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試

20、樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測。5. 毛細(xì)管等速電泳 capillary isotachophoresis ，CITP第32頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四 3. 不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(=E)，淌度大的離子區(qū)帶電場強(qiáng)度小； 沿出口到進(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4 電場強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴(kuò)散到“3”號，該區(qū)電場強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)； 4. 特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用；capillary isotacho

21、phoresis ，CITP第33頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四(1)在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動(dòng)相，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過程.(2)這種方式將HPLC發(fā)展的固定相引入到CE中，增加了選擇性，但又保持了CE的固有優(yōu)點(diǎn)，是一種有發(fā)展前景的分離模式。6. 毛細(xì)管電滲色譜 capillary electroosmostic chromatography ，CEC第34頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.10.5 應(yīng)用與進(jìn)展1. 離子分析2. 藥物分析3. 手性化合物分析4. 氨基酸與蛋白質(zhì)分析5

22、. 核酸分析及DNA排序6. 新進(jìn)展第35頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四1. 離子分析 analysis of ion陽離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子； 陽極進(jìn)樣，陰極檢測； 具有很高的靈敏度；第36頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；第37頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四2. 藥物分析 analysis of pharmaceutics 檢測體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；第38頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLG法第39頁，共44頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)50分，星期四3.手性化合物分析 analysis of chiral comp