微生物實驗室培養(yǎng)(3)講稿

1、關于微生物的實驗室培養(yǎng) (3)第一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月微生物的類群原生生物原核生物真菌病毒如酵母菌單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等微生物包含了除植物界和動物界以外的所有生物無細胞結構真核細胞細菌、藍藻原核細胞第二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月專題2 微生物的培養(yǎng)與應用課題1 微生物的實驗室培養(yǎng)第三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月課題1 微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)條件：（1）為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件（2）確保其他微生物無法混入研究和應用微生物的前提防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物第四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一

2、.培養(yǎng)基 1概念：人們按照微生物對 的不同需求，配制出的供其 的營養(yǎng)基質(zhì)。（1）按物理性質(zhì)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。（2）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。（3）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。2.分類：營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖第五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌 分離自養(yǎng)型微生物加入唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細菌分離金黃色葡萄球菌第六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月幾種菌落及其

3、形態(tài)第七張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月幾種菌落及其形態(tài)第八張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月微生物需要的四大類營養(yǎng)要素物質(zhì)是：3.培養(yǎng)基的構成1.碳源 2.氮源 3.無機鹽 4.水凡是能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。無機碳源：CO2；NaHCO3等有機碳源：糖類、脂肪酸、蛋白質(zhì)、花生粉餅、石油等概念來源：不同微生物所利用的碳源不同：1.微生物的碳源異養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳有機物（有機碳）自養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳無機物（無機碳）第九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月無機氮源：N2、銨鹽、硝酸鹽、NH3等有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠為微生物提

4、供N元素的營養(yǎng)物質(zhì)。2.微生物的氮源概念：來源：固氮微生物所利用的氮源是：3.特殊要求培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(微生物生長不可缺少的微量有機物）如維生素、某些氨基酸、堿基)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。 氮氣第十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月例1、下列物質(zhì)可作為培養(yǎng)硝化細菌碳源、氮源和能源的依次是 （ ）A含碳無機物、氨、氨B含碳無機物、氮、硝酸鹽C含碳有機物、氨、光D含碳有機物、硝酸鹽、氨例2 、要將土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）與其它細菌分離出來，應將它們接種到（ ）A加入指示劑的鑒別培養(yǎng)基 B含有蛋白胨的固體培養(yǎng)基C沒有有機氮的

5、選擇培養(yǎng)基 D營養(yǎng)要素全面的液體培養(yǎng)基練一練AC第十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月牛肉膏當中含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類。的水溶性物質(zhì)。牛肉膏為微生物提供碳源、氮源、磷酸鹽和維生素.蛋白胨主要提供氮源和維生素。 第十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1.無菌范圍：實驗操作空間,操作者的手、衣著消毒.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行.實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸.超凈工作臺二.無菌技術：防止外來雜菌的污染第十三張，P

6、PT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月耐高溫需保持干燥的 物品，160170 12小時接種環(huán)、接種針等 金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化因素，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸或煤酚皂溶液等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121、1530min2.消毒與滅菌：第十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋第十五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑（70%

7、酒精等）紫外線針對不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）吸管實驗操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基1、消毒方法2、滅菌方法干熱滅菌第十六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手 答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考第十七張，P

8、PT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g瓊脂20.0g三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，稱取時？牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解取紙蛋白胨、NaCl瓊脂補水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：1mollNaoH調(diào)制微堿5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿第十八張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月?思考1溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱? 加瓊脂的目的是什么?可保證粘附在

9、稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差作為凝固劑第十九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月思考2 在滅菌前, 用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？ 培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？?在滅菌時能避免水蒸汽凝結時浸濕棉塞；在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用不能,因為培養(yǎng)皿要保持干燥,應該用干熱滅菌第二十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月倒平板約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基第二十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

10、問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第二十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要

11、用這個平板培養(yǎng)微生物。第二十三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）純化大腸桿菌 微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1.平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱菌落。第二十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_在_旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞 將試管口通過火焰 .將已_的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液 左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃_條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。.將

12、試管通過火焰，并塞上棉塞 火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 倒置第二十五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月劃3個平板1個不劃線（空白對照）第二十六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月問題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種

13、，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。第二十七張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第二十八張，PPT共三十

14、七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.稀釋涂布平板法 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。 稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。第二十九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月系列稀釋操作101102103104105106 (1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號。 (2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。 (3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重

15、復步驟2，直至到第六支試管。第三十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月涂布平板操作(1)將涂布器浸在盛有70的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻810s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。第三十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第三十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2.菌種培養(yǎng)：3.實驗結果觀察將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)12h24h

16、后，觀察并記錄第三十三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月涂布平板操作討論 涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？ 應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。 將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)1224h后進行觀察并記錄結果。第三十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？ 未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？ 如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四、結果分析與評價第三