RNA探針雜交步驟以及效價(jià)測定

1、RNARNA探針雜交步驟以及效價(jià)測定RNA 探針是一段單鏈cDNA 分子，本文總結(jié)了RNA 探針的分類、制備方法、探針的純化、雜交前的留意事項(xiàng)，RAN探針效價(jià)的測定以及探針的選擇。RNA 原位雜交中的探針(一)探針的種類RNA 探針是指帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈 cDNA 或cRNA RNA 雜交中所使用的探針依其來源可分為三種cDNAcRNA探針和人工合成寡核苷酸探針。單鏈cDNA 探針：由于 cDNA 中不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，又抑制了雙鏈cDNA 探針在雜交反響中兩條鏈之間復(fù)性的缺點(diǎn)，從而提高了雜交反響的敏感性。但由于單鏈 cDNA 探針的制備比較困

2、難，在RNA 原位雜交中已很少見有應(yīng)用。cRNA 探針：是以 cDNA 為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。由于它是一種單鏈探針，因此也避開了應(yīng)用cDNA 探針做雜交反響時(shí)存在的兩條鏈之間的復(fù)性問題。cRNA RNA 之間形成的雜cDNA-RNA 雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA 之間形成的雜交體不受RNA 酶的影響。因此雜交反響后可用RNA cRNA 探針具有以上這些優(yōu)點(diǎn)，cRNA 探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA 探針高出8 cRNA 探針的缺點(diǎn)是：探針的制備過程比較簡單，需要較好的分子生物學(xué)試驗(yàn)設(shè)備，它對(duì)RNA 酶敏，易受破壞，操作中要防范RNA酶污染。寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸

3、為原料，通過DNA 合成儀合成，避開了真核細(xì)胞中存在 與 mRNA 形成的雜交體不如cRNA-RNA 雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標(biāo)記物少，敏感性較低。依標(biāo)記物不同，探針又可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。前者主要包括 3H、35C、32P 125I 等，不同的同位素探針其穿透力、定位和半衰期各不一樣，無一種同 境和危害安康等緣由，在RNA 原位雜交中應(yīng)用同位素標(biāo)記探針已日趨削減，而非同位素標(biāo) 高辛標(biāo)記的 cDNA、RNA 和寡核苷酸探針，不但具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還抑制了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干擾等缺點(diǎn)，其應(yīng)用越來越廣泛。(二)探針的標(biāo)記在 RNA

4、 原位雜交中，不僅要選擇適當(dāng)?shù)奶结槪疫€要使探針得到有效的標(biāo)記。探針標(biāo)記法有酶反響法和化學(xué)反響法。酶反響法：用于RNA 探針的酶反響法主要為末端標(biāo)記法與體外轉(zhuǎn)錄法。末端標(biāo)記法是將標(biāo)記物導(dǎo)入線DNA RNA 5”3”端的一種標(biāo)記法，末端標(biāo)記適用于合成寡核苷酸探針的標(biāo)記，用末端標(biāo)記制備的探針一般攜帶的標(biāo)記分子較少。體外轉(zhuǎn)錄法：體外轉(zhuǎn)錄法是一種制備與片段序列一樣的單鏈RNA 探針的方法。進(jìn)展體外轉(zhuǎn)錄時(shí)，先將靶核苷酸序列轉(zhuǎn)入到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體中，然后在RNA 聚合酶的作用下，以DNA 為模板，以含有標(biāo)記的三磷酸苷為原料，對(duì)啟動(dòng)子下游的序列進(jìn)展轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子本身并不被轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)

5、錄啟動(dòng)子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T3、T7。當(dāng)兩個(gè)不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合在載體多位點(diǎn)的兩側(cè)將質(zhì)粒線性化。SP6 噬菌體的RNA 聚合酶對(duì)SP6 啟動(dòng)子序列具有高度的親和性，從而啟動(dòng)4 種三磷酸核糖核苷和相應(yīng)的噬菌體RNA 聚合酶存在的條件下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。如反響物中含有標(biāo)記的三磷酸核糖苷核，全部的RNA 就被標(biāo)記。 為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。 已發(fā)表的文獻(xiàn)說明，由于檢出雜交信號(hào)受到多種因素抑制，只能限于靶RNA 豐富的細(xì)胞或組織中，RNA 雜交對(duì)低拷貝的基因檢測不抱負(fù)。近年來間接標(biāo)記法得到較快進(jìn)展，先將標(biāo)記物結(jié)合在探針上，通過特異性識(shí)別，由特異性結(jié)合多種酶，對(duì)檢測的雜交信號(hào)作用

6、放大， 這一類標(biāo)記法已呈現(xiàn)極好的進(jìn)展前景。(三)探針的純化被結(jié)合到探針中去的剩余dNTP 等小分子。為將摻入并結(jié)合到cDNA、cRNA 和標(biāo)記寡核苷酸與游離的標(biāo)記寡核苷酸分開，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進(jìn)展純化。乙醇沉淀法的原理是：DNA DNA dNTP 此反復(fù)乙醇沉淀能將兩者分開。核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì) 變性劑，以增加去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的效果。由于酚雖能有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA 1015% ploy(A)RNA面的局限，混合使用酚與氯仿，對(duì)于RNA 提取顯得更加重要，氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。

7、(四)雜交前預(yù)備載玻片和蓋玻片的處理為有效防止外源性RNA 酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理。5% 12 小時(shí)，用354030min，再3 5min180 烤箱內(nèi)烘烤 46 小時(shí)，蓋玻片可按近期內(nèi)所需量，用鋁箔紙包裹后烘烤后存放。片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標(biāo)本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。明膠涂片制備10 1000 40504 25% 硫酸鉻鉀溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS 0.1%。將烘烤后的載玻片10min1% 多聚甲醛，pH7.4PBS 10min;1% 多聚甲醛，pH7.4 的PBS 10min，在室溫下枯燥玻

8、片。60 烤箱內(nèi)過夜備用。多聚左旋賴氨酸涂片的制備24mg 多聚左旋賴氨酸，分子量在300000 以上，溶于1ml 消毒去離子水中。經(jīng)旋渦器反復(fù)攪拌，吸取2030l 滴加到玻片一側(cè)，再取另一張載玻片復(fù)合，將賴氨酸溶液均勻涂抹在裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉛筆標(biāo)出，室溫下枯燥切片后，在 60烤箱內(nèi)過夜備用。硅烷涂片的制備5 毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)250ml 丙酮內(nèi)。將60min，用雙蒸水漂洗2 次，每次10min 枯燥玻片后，60烤箱內(nèi)過夜備用。留意事項(xiàng)：制備便利為原則，在制備過程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮

9、膚上的RNA 酶的污盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效。穎標(biāo)本的儲(chǔ)存和冰凍切片制備為 RNA 原位雜交作穎標(biāo)本儲(chǔ)存和冰凍切片過程中，應(yīng)嚴(yán)防RNA 酶的污染，制備過程中所使用的容器、刀具等均經(jīng)高壓消毒或清潔后用 0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonateDEPC)水清洗。RNA 1.51.2cm 0.2cm，應(yīng)快速4% 424 30% 蔗糖PBS 溶液內(nèi)，4 冰箱內(nèi)過夜。次日可將標(biāo)本儲(chǔ)存于-80 或-140 超低溫冰箱內(nèi)保存。如作冰凍切片，先將組織在-20恒冷切片機(jī)內(nèi)停留，待溫度上升后，然后在恒冷冰凍切片7m 402 小時(shí)后儲(chǔ)存在-80 或-140 超低溫冰箱內(nèi)備用。標(biāo)本的固

10、定和石蠟切片的制備石蠟切片作RNA 原位雜交的，也應(yīng)嚴(yán)防RNA 酶的污染，容器、刀具等去除RNA 酶的過程同冰凍切片。為防止RNA 快速降解，離體后標(biāo)本應(yīng)馬上有效固定。為保存良好組織構(gòu)造，有利探針的穿透力，應(yīng)選用適宜的固定劑。 長時(shí)間固定可引起RNA 降解。其缺乏之處是：組織形態(tài)構(gòu)造的保持不如交聯(lián)固定劑。交聯(lián)固定劑能較好保存組織中RNA 和組織形態(tài)構(gòu)造，但固定時(shí)間過長，也可發(fā)生胞漿和胞核內(nèi)大分子化合物形成交聯(lián)，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。4%多聚甲醛固定液4g 0.25g 100ml 0.01mol/L pH7.0 PBS 溶液，組織在常溫下浸4% 4 小時(shí)，每1 10min4 0.0

11、1mol/L pH7.0的PBS 2 30min。福爾馬林醋酸固定液50% 酒精、10% 5% 醋酸組成。在常溫下將組織浸泡41 10 4 50% 酒精漂2 30min。(五)雜交前探針的選擇RNA 探針：RNA 50150 500 個(gè)20 500 RNA 探針則在雜交前用有限堿基水解法把握其長度。t=Lf- Lo/ K LoLf (Lo=核酸探針原長度(kb)，Lf=核酸探針?biāo)夂笏栝L度(kb)，K是常數(shù)率=0.11kb/min)。在室溫中參加以下終止水解：3mol/L 醋酸鈉，6.6l(0.1mol/L)1.3l(終濃度0.5%)。 ) 2 1400rpm 30min。留神將乙醇倒出，待

12、試管內(nèi)枯燥后再用無菌ddH2O 10ng/l 濃度。(5)10% 60 的尿素中電泳檢測。探針的長度 度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標(biāo)記cRNA 探針的濃度為 0.5ng/l，而非放射性標(biāo)記cRNA 探針的濃度 1.0ng/l。雜交液的量要適當(dāng)，每張切片以3050l 為宜。保持雜交液不流失的關(guān)鍵是，載玻片的清潔處理必需徹底，應(yīng)用雜交罩等也很必要。雜交的溫度和時(shí)間設(shè)置和調(diào)整雜交溫度是RNA (meltingtemperature Tm)20-30。多數(shù)RNA 原位雜交Tm 95，由于這一溫度對(duì)保存組織形態(tài)完整和組織切片的粘附將產(chǎn)Tm 1% 甲酰胺濃度可降低 0.72。另外雜交體中

13、GC 的百分比、雜交體長度以及雜交液中 Na+的濃度也與Tm呈正相關(guān)。 長會(huì)增加非特異性著色。一般RNA 原位雜交承受雜交孵育過夜，在黑暗環(huán)境下進(jìn)展，可以避開光線對(duì)甲酰RNA 探針的制備樣本DNA 的性質(zhì)1、 純度：高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取并純化2、 大?。?00bp-10kb10kb 需要限制性內(nèi)切酶的酶切3、 含量：1ug DNA10ug 標(biāo)記RNA樣品制備1、 在克隆插入位點(diǎn)下游，使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化2、 為了避開不需要序列的轉(zhuǎn)錄，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)5段進(jìn)展修飾3、 酶切后，使用高純化的PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化或工作液的預(yù)備溶液 預(yù)備 儲(chǔ)存 用途水：PCR 0.1% 15-25

14、 調(diào)整溶液體積或DMPC 處理水 methylpyrocarbonate resuspend RNAEDTA 0.2M ethylene-diamino- 15-25 終止反響Tetraacetic acid, pH 8.0步驟標(biāo)準(zhǔn)RNA 標(biāo)記反響1、1ug 純化的模版DNA 4ul 比照DNA 13ul 體系2、將反響物均放在冰上，然后參加以下試劑：10 NTP labeling mixture 2ul10 Transcription buffer 2ul Protector RNase inhibitor 1ulRNA Polymerase SP6 or 2ul RNA Polymeras

15、e T7輕輕混勻并瞬時(shí)離心，37孵育 2h。(長時(shí)間的孵育并不能增加標(biāo)記RNA)32ul DNase I，除去模版DNA;3715min(試劑盒可不做此步驟)42ul 0.2M EDTA(pH8.0)終止反響。探針的儲(chǔ)存:-15 至-251 年，避開反復(fù)凍融標(biāo)記效率的測定RNA Dilution Buffer：DMPC 處理的ddH2O:20SSC：formaldehyd=5：3：2，穎配制rna探針怎么檢測效率問題：我用 DIG 法檢測 DNA 含量，可是在探針標(biāo)記效率檢測時(shí)，按試劑合說明書稀釋 1ng/ul 10pg/ul 3pg/ul 1pg/ul 0.3pg/ul 0.1pg/ul 0

16、.03pg/ul 0.01pg/u4(Lebeled Control DNA )0.03pg/ul的點(diǎn)顯色，而且我做的標(biāo)記效率很低。請(qǐng)教各位，怎樣加深Lebeled Control DNA 顯色效果和提高探針標(biāo)記效率? 優(yōu)化。假設(shè)kit 里面帶的control DNA 都達(dá)不到應(yīng)有的靈敏度，可能是操作過程有問題，由于 DNA 是標(biāo)記好的，只剩下與抗體反響和顯色兩個(gè)步驟了，可以從這兩步找找緣由。至于 過程，比方DNA 過大的話應(yīng)當(dāng)用適宜的內(nèi)切酶切成小片段，延長標(biāo)記時(shí)間等等，一般標(biāo)記 也會(huì)影響雜交效率。一般的DIG 檢測的kit 都是隨機(jī)引物擴(kuò)增法標(biāo)記, 一般都能到達(dá)濃度標(biāo)記的要求.假設(shè)確實(shí)標(biāo)記的

17、效率上不去, PCR 直接擴(kuò)增法進(jìn)展標(biāo)記.具體方法是,PCR 的條件(引物5pM/20uL), dNTPs(2.5mM)dATP,dCTP,dGTP,dTTPDIG-dUTP,混合至2.5mM/each(dTTP2mM DIG-dUTP0.5mM), PCR 就好了(PCR 的特異性,再去標(biāo)記).探針長度機(jī)敏,從 100目的片段長度都可以,推舉 150300bp 之內(nèi).標(biāo)記的效率很高,lz不妨一試.固然DIG-dUTP 比較貴,但是比重買試劑盒合算, 而且由于標(biāo)記效率高, 一次PCR 20 微升為例,20100mL, DIG-dUTP可以用到死啊地高辛標(biāo)記的dna，rna 探針怎么檢測效率啊?我做植物原位雜交的，用的探針是地高辛標(biāo)記的 dna，rna 探針，現(xiàn)在試驗(yàn)沒有結(jié)果，我想檢測下探針的效率，有誰