中南民族大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)教研室課件

1、中南民族大學(xué) 藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)教研室尼龍固定化木瓜蛋白酶化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕瘜W(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)12學(xué)習(xí)尼龍固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。掌握共價(jià)結(jié)合法固定化酶的原理和方法。中南民族大學(xué) 藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)教研室2.實(shí)驗(yàn)原理化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)1234酶不與產(chǎn)品混合，制品易于純化。在大多數(shù)情況下，可提高酶的穩(wěn)定性。提高酶的使用效率，降低生產(chǎn)成本。利用固定化酶，工業(yè)上可以大批量、連續(xù)化生產(chǎn)定義：通過(guò)物理或化學(xué)的方法，將水溶性的酶與水不溶性載 體結(jié)合，使酶固定在載體上，并在一定的空間范圍內(nèi) 進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶。固定化酶的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：2.實(shí)驗(yàn)原理化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)包埋法共價(jià)鍵結(jié)

2、合法交聯(lián)法酶的固定化方法有：吸附法(物理吸附、離子吸附)12343.實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)材料(1)尼龍布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方塊(2)吸水紙儀器 (1)恒溫水浴鍋 (2)紫外分光光度計(jì) (3)冰箱及玻璃器皿中南民族大學(xué) 藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)教研室3.實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí) (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸緩沖液配制 (6)0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH值7.8

3、) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸緩沖液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2) (10)激活劑：用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制，內(nèi)含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。主要試劑4.實(shí)驗(yàn)步驟化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)2、酶活力測(cè)定(1)溶液酶活力測(cè)定：取0.2 mL酶液，加入2.3 mL激活劑，于 37 下預(yù)熱10min，加入37預(yù)熱的1%酪蛋白溶液mL

4、， 準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL終止 酶反應(yīng)。對(duì)照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他與測(cè)定管相同，以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min或 過(guò)濾，取其上清液于波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度。在上述條 件下，每10 min增加0.001個(gè)吸光度為1個(gè)酶單位(U)。(2)殘留酶活力測(cè)定：方法同溶液酶活力測(cè)定。(3)固定化酶活力測(cè)定：取一塊尼龍布固定化酶，加入2.5mL激 活劑，其余步驟與溶液酶測(cè)定相同。4.實(shí)驗(yàn)步驟化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)表1 酶活力測(cè)定試劑溶液酶固定化酶殘留酶CK12CK12CK12激活劑（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或塊）0.20.20.21塊1塊1塊0.20.20.237保溫5min37 1%酪蛋白（mL）11111137反應(yīng)10 min20% TCA (ml)搖勻2222222221%酪蛋白（mL）111過(guò)濾5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及計(jì)算化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)活力回收=固定化酶總活力數(shù)溶液酶總活力數(shù)100%相對(duì)活力=固定化酶總活力數(shù)(溶液酶總活力數(shù)-殘留酶活力數(shù))100%6.注意事項(xiàng)尼龍布的處理是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，既要讓其充分地活化，又不能使其破碎。固定化酶溶液濃度最好為0.51 m