高效毛細管電泳PPT

1、關(guān)于高效毛細管電泳2022/9/8第一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8一、概述 generalization 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。 1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎；第二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/

2、81.1、經(jīng)典電泳分析 traditional electrophoresis 利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細管電泳。第三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/81.2

3、、高效毛細管電泳分析 high performance capillary electrophoresis高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進： 一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細管； 二是采用了高達數(shù)千伏的電壓。 毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加， 高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。第四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8分離過程 電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。 帶電粒子的遷移速度=電泳+電

4、滲流；兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負極最先流出； 中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反。電滲流 電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,一則可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。第五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化 電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少 進

5、樣量極少，水介質(zhì)中進行；4.應(yīng)用范圍極廣 有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護、材料等； 第六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8二、高效毛細管電泳理論基礎(chǔ) 2.1、高效毛細管電泳(HPCE)基本原理 電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？ 當(dāng)帶電離子以速度 在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE = qE 阻 力：F = f故： qE = fq離子所帶的有效電荷；E 電場強度；離子在電場中的遷移速度；f 平動摩擦系數(shù) ( 對于

6、球形離子： f =6； 離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑； 介質(zhì)的粘度； )第七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8所以，遷移速度：（球形離子） 物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度 ：單位電場強度下的平均電泳速度。 第八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/82.2、電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosis and electroosmotic flow1.電滲流現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。 當(dāng)液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固

7、體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 第九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/82.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流 石英毛細管柱，內(nèi)充液pH3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。 在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度電滲流。第十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/83.HPCE中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取

8、決于電滲淌度和電場強度E。即 電滲流 = E電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即 = 00真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細管壁的Zeta電勢。 電滲流 = 0 E實際電泳分析，可在實驗測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計算 電滲流 = Lef/teoLef 毛細管有效長度； teo電滲流標記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。第十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8HPCE中電滲流的方向 電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極； 石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法

9、： （1）毛細管改性 表面鍵合陽離子基團； （2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。第十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/84. HPCE中電滲流的流形 電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）； 液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。第十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/85. HPCE中電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的57倍； 各種電性離子在毛細管柱中

10、的遷移速度為： + =電滲流 + +ef 陽離子運動方向與電滲流一致； - =電滲流 - -ef 陰離子運動方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。第十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/82.3、HPCE中影響電滲流的因素 factors influenced electroosmosis1.電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當(dāng)毛細管長度一定時

11、，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；第十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/83. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響 對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大； pH3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。

12、緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。第十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8第十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/84. 溫度的影響 毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”； 焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量； HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強度成正比。 溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%3%；第十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/85. 添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2

13、）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向； 加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。第十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/82.4、淌度 mobility 淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度； 淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1.絕對淌度(absolute mobility)ab 無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚?。2.有效淌度(effective mobility)ef 實際溶液

14、中的淌度(實驗中測定的)。 ef=aii ai 溶質(zhì)i 的解離度；i 溶質(zhì)i 在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度 ap 離子在實際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）： ap=ap E第二十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/82.5、影響分離效率的因素區(qū)帶展寬 factors influenced the efficiencyband broadening 1.縱向擴散的影響 在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：2=2Dt 由擴散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進樣的影響 當(dāng)進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向

15、擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度： Winj= (24D t )1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%2%。第二十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/83.焦耳熱與溫度梯度的影響 電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計算：m電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I工作電流：cm電解質(zhì)濃度； 散熱過程中，在毛細管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。 改善方法： （1）減小毛細管內(nèi)徑； （2）控制散熱；第二十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/84.溶質(zhì)與管壁間的相互作用 存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬； 蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)

16、多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。 細內(nèi)徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機會。 減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對電滲流影響不大。第二十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/85.其他影響因素 （1）電分散作用對譜帶展寬的影響 當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的

17、影響 一般情況下，HPCE中不存在層流，但當(dāng)毛細管兩端存在壓力差時，出現(xiàn)拋物線形的層流； 產(chǎn)生的原因：毛細管兩端液面高度不同。 實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。第二十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8三、高效毛細管電泳儀high performance capillary electrophoresis apparatus第二十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8儀器2第二十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8儀器3第二十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/83.1、儀器流程與主要部

18、件 process and main assembly 電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器；（可檢測到：10-1910-21 mol/L）第二十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/81.高壓電源（1）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2. 毛細管柱 （1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學(xué)、機械性能差； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長度電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種

19、類離子由于差速遷移被相互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式；第三十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/84.2、毛細管凝膠電泳capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。

20、第三十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8 1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。4.3、 膠束電動毛細管色譜（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在電場力的作用下，膠束在柱中移動。第三十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8 2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動； 5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。 3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)

21、合的較牢，流出時間長； 4.可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應(yīng)用范圍；第三十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8 1. 根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；4.4、毛細管等電聚焦capillary isoelectric focusing，CIEF第三十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/8 4. 聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離； 5. 陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6. 加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測； 7. 電滲流