單克隆抗體的制備及應(yīng)用詳解演示文稿

1、單克隆抗體的制備及應(yīng)用詳解演示文稿第一頁，共三十五頁。優(yōu)選單克隆抗體的制備及應(yīng)用第二頁，共三十五頁。單克隆抗體的簡介1 第一部分第三頁，共三十五頁。單克隆抗體的簡介1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)。他們把可在體外培養(yǎng)和無限增殖的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。這種雜交瘤，通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（ m

2、Abs ），簡稱單抗。第四頁，共三十五頁。 單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷2 第二部分第五頁，共三十五頁。鼠源性單克隆抗體嵌合性單克隆抗體人源化單克隆抗體全人源單克隆抗體鼠源性單克隆抗體是來源于鼠蛋白，因此對于人體而言是外來物從而易被抵抗。嵌合性單克隆抗體是指同時具有人和鼠的來源構(gòu)成，通常是30%比70%。鼠源部分用來結(jié)合抗原，人源部分用來誘導(dǎo)產(chǎn)生療效。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。 。單克隆抗體技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷第六頁，共三十五頁。 單克隆抗體的制備3 第

3、三部分第七頁，共三十五頁。單克隆抗的制備動物免疫11234細(xì)胞融合和選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化大量制備及純化第八頁，共三十五頁。單克隆抗體制備的簡易流程第九頁，共三十五頁。動物免疫抗原制備：制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，同時應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。第十頁，共三十五頁。免疫動物的選擇：一般的雜交瘤生產(chǎn)都選用BALB/c小鼠或LOU/c大鼠

4、作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。第十一頁，共三十五頁。免疫程序的確定：在設(shè)計(jì)免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。第十二頁，共三十五頁。目前常用的免疫程序第十三頁，共三十五頁。細(xì)胞融合和選擇性培養(yǎng)第十四頁，共三十五頁。融合過程中，常采用聚乙二醇（PEG）作為融合誘導(dǎo)劑。PEG促進(jìn)細(xì)胞融合的機(jī)制可能是與臨近細(xì)胞膜的水分相結(jié)合使細(xì)胞間的水分被取代，降低細(xì)胞表面的極性，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，

5、引起細(xì)胞膜的融合 。注意：PEG 的分子量和濃度與融合效果相關(guān)，PEG 的分子量越大，濃度越高，其促融率也越高，但其粘度和細(xì)胞的毒性也隨之增大；濃度低于30時，融合率低。第十五頁，共三十五頁。 HAT選擇性培養(yǎng)1964年Littlefield首先發(fā)明了HAT (HHypoxanthine次黃嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，TThymidine 胸腺嘧啶核苷) 選擇性培養(yǎng)。HAT選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途徑設(shè)計(jì)的。第十六頁，共三十五頁。細(xì)胞內(nèi)DNA的生物合成途徑主要生物合成途徑補(bǔ)救途徑甲氨喋呤次黃嘌呤次黃嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脫氧核苷酸D

6、NA利用糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA葉酸拮抗物氨基蝶呤可阻斷主要途徑第十七頁，共三十五頁。小鼠HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞（Sp2/0）融合后的細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中結(jié)局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡 存活第十八頁，共三十五頁。雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化第十九頁，共三十五頁。 克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時凍存，防染色體丟失、變異及污染第二十頁，共三十五頁。mm114433224

7、24442333244444222443333333333有限稀釋法第二十一頁，共三十五頁。大量制備及純化大量制備第二十二頁，共三十五頁。純化方法1、鹽析2、凝膠過濾3、離子交換層析4、親和層析法第二十三頁，共三十五頁。鹽析：用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。 血清 50%飽和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%飽和度硫酸胺 上清 沉淀 擬球蛋白 r球蛋白第二十四頁，共三十五頁。 凝膠過濾法：干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時，

8、大分子蛋白不能穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入。膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex）瓊脂糖凝膠(Sepharose)第二十五頁，共三十五頁。離子交換層析法DEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽離子交換劑第二十六頁，共三十五頁。將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）。A蛋白-Seph

9、arose CL 4B親和層析法：第二十七頁，共三十五頁。單克隆抗體的應(yīng)用4 第四部分第二十八頁，共三十五頁。作為生物治療的導(dǎo)向武器作為免疫抑制劑作為研究工作中的探針增強(qiáng)抗原的免疫原性檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑農(nóng)獸藥的快速檢測作為親和層系的配體應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用第二十九頁，共三十五頁。作為親和層系的配體單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，固定在層析柱上，通過親和層析，即可從復(fù)雜的混合物中分離、純化這一特定成分。 優(yōu)點(diǎn)：與其他提取方法相比，具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點(diǎn)。第三十頁，共三十五頁。蛋白質(zhì)提純先用待提純蛋白質(zhì)制成

10、單抗，再將單抗固定在惰性固相 基質(zhì)上，制成層析柱。而后倒入混合液，當(dāng)混合液流經(jīng)單抗時，相應(yīng)的蛋白質(zhì)與單抗特異性結(jié)合，雜質(zhì)則隨洗脫劑流走。再用特殊的洗脫劑將蛋白質(zhì)洗脫下來，則可將蛋白質(zhì)提純。在親和層析中單克隆抗體是主要的配體第三十一頁，共三十五頁。作為生物治療的導(dǎo)向武器以抗腫瘤為例：將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質(zhì)連接，利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用，將藥物或放療物質(zhì)攜帶至靶器官，直接殺傷靶細(xì)胞，稱為腫瘤導(dǎo)向治療。另外，將放射性標(biāo)記物與單克隆抗體連接，注入患者體內(nèi)可進(jìn)行放射免疫顯像，協(xié)助腫瘤的診斷。常見抗腫瘤細(xì)胞毒劑：化療藥物、細(xì)菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。這不僅提高了抗體的療

11、效，也可降低細(xì)胞毒劑對正常細(xì)胞的毒性反應(yīng)。第三十二頁，共三十五頁。作為免疫抑制劑抗人T淋巴細(xì)胞單抗（McAb）作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)，其作用機(jī)理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。例子：對于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能夠減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。第三十三頁，共三十五頁。作為研究工作中的探針利用單克隆抗體的特性可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細(xì)胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，進(jìn)而可以從理論上闡明其機(jī)理。例子：用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能快速地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子在細(xì)胞中的位置和分布。第三十四頁，共三十五頁。3佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對抗原的處理5可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體2增加抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬7改變抗體的產(chǎn)生類型以及產(chǎn)