DNA的體外重組與轉(zhuǎn)移課件

1、第六章 DNA的體外重組與轉(zhuǎn)移 外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞重組DNA分子的構(gòu)建需要考慮三個因素 （1）實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能地簡單易行； （2）連接形成的“接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； （3）外源基因必須在表達(dá)載體的啟動子下，并置于正確的ORF中，以便目的基因的表達(dá)。第一節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建一、粘性末端的連接 DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起。優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作簡單，易于回收外源DNA片段缺點(diǎn)： （1）不易定向克隆 （2） 難插入特定的基因 （3）大片段DNA的重

2、組率低 （4）載體易發(fā)生自身串聯(lián) （5）目的片段自身各拷貝之間可能自連1、一種限制性核酸內(nèi)切酶酶切的粘性末端間的連接堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質(zhì)粒DNA分子再環(huán)化 用識別序列完全不同的一對限制性酶同時消化一個特定的DNA分子，將會產(chǎn)生具有兩個不同粘性末端的DNA片段，并可使該片段按一定方向插入到載體分子上，當(dāng)然載體分子需用同一對限制性內(nèi)切酶處理。2、不同限制性核酸內(nèi)切酶酶切的粘性末端的連接 另外，可應(yīng)用同尾酶（識別序列不同，但末端相同）連接。連接后，形成的重組子不被原來的酶識別切割，但有時可被第三種酶的識別切割。同尾酶的連接 對于兩個不能互補(bǔ)的粘性末端的連接，通常采用平頭末端的連接方式，

3、即先將其處理成平頭末端，再連接，具有兩種情況。 （1）5突出末端的補(bǔ)平：大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段； （ 2）3突出末端的切平：T4噬菌體DNA聚合酶或S1核酸酶。 平頭末端連接的缺點(diǎn)：連接效率低、破壞原有的識別序列、雙向插入及多拷貝插入。二、平頭末端的連接1、直接連接 T4 DNA連接酶雖然能直接連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-53缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不易自身環(huán)化、連接效率高、所有DNA片段均可用此法。非酶切位點(diǎn)操作繁鎖、外源片段難以回收、有可能影響外源基因的表達(dá)。 用T4 DNA連接酶連到平端

4、DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（1）銜接物（linker）連接 linker 用化學(xué)合成法合成的一段8-12bp的含有特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用3、人工接頭法缺點(diǎn)：a、可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。 如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段，需進(jìn)行甲基化保護(hù)及去保護(hù)，該操作較繁瑣。b、能給載體連接上Polylinker:優(yōu)點(diǎn)：（2）DNA接頭 (adapter)連接法1978年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter

5、用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。 adapter 一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用 接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。缺點(diǎn)： 先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。 接頭連接在載體上以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我連接三、PCR產(chǎn)物的連接1、在引物的5端設(shè)計酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3端1520bp與模板互補(bǔ)；5端610bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。避免與所擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。引

6、物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5-3GCAGAATTC互補(bǔ)序列5-33模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物5-33復(fù)性延伸模板模板33帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5-3CCTAGGCGGPCR產(chǎn)物-53-CGTCTTAAGGGATCCGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5-3CCTAGPCR產(chǎn)物-53-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！2、與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3端一般都有一個A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3端人為地各加一個T 利用

7、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)1、插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。2、DNA插入的方向正確用雙酶切 由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼子 尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATG CGA ATTC載體GGAGAATTC ATG CAG插入片段EcoRIEcoRIATG CGA ATT CAT GCA G重組但移碼突變！4、防止載體

8、自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量連接反應(yīng)體系中，插入片段比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體 載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片段以單鏈連接。53載體插入片段（3）用同聚物加尾法處理載體2. 載體自身環(huán)化連接（能存活）3. 載體之間互相連接（能存活）4. 插入片段互相連接（不能存活）5. 一個載體與幾個插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果6. 幾個載體與一個插入片段重組（能存活）1. 一個載體與一個插入片段重組（能存活） 受體細(xì)胞：能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持、具有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。 根據(jù)細(xì)胞的種類可分為三類： * 原核生

9、物受體細(xì)胞 * 植物受體細(xì)胞 * 動物受體細(xì)胞第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞1、原核生物受體細(xì)胞特點(diǎn)： 1）染色體裸露，便于外源DNA重組 2）基因組簡單，便于進(jìn)行遺傳分析 3）單細(xì)胞生物，易于獲得一致性受體細(xì)胞 4）培養(yǎng)條件簡單，生長快，實(shí)驗(yàn)周期短主要的原核受體細(xì)胞： 大腸桿菌，枯草桿菌，藍(lán)細(xì)菌等應(yīng)用 * 保存和擴(kuò)增目的基因 * 表達(dá)基因產(chǎn)物 * 構(gòu)建基因組文庫2、植物受體細(xì)胞特點(diǎn)： 1）具有體細(xì)胞全能性，一個分離的活細(xì)胞 在合適的條件下可分化成植株 2）具有堅硬的細(xì)胞壁，可以纖維素酶處理 獲得原生質(zhì)體.應(yīng)用： 轉(zhuǎn)基因棉花，水稻，玉米，馬鈴薯，煙草3、動物受體細(xì)胞特點(diǎn) 1）體細(xì)胞一般無全能性，只

10、能分化到細(xì)胞株 2）生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞等具有全能性，可分 化、培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因羊，鼠，兔，豬，牛，檢測動物核酸疫苗的表達(dá)等。一、重組體導(dǎo)入原核細(xì)胞（一）感受態(tài)大腸桿菌的制備處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。2、目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。1、概念使用喪失了限制體系的大腸桿菌。3、菌種（以E.coli為例） 在0 的CaCl2 低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹， Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜的通透性。 轉(zhuǎn)化時加入DNA后， Ca2+ 能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶的羥基磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42 熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間

11、隙，即可使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。4、制備原理5、制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4冰上 5-10 min4離心收集菌用冰冷的（50-100） mMCaCl2重懸4離心收集菌4離心收集菌分裝、-70 凍存用冰冷的（50-100）mMCaCl2重懸On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重懸（二）重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞的方法1、轉(zhuǎn)化（transformation)（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化 DNA分子通過與細(xì)胞膜結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程10ng重組DNA100L感受態(tài)菌冰上靜置30分鐘42C 4590秒加入1mL LB培養(yǎng)基37搖45分1.5小時10-

12、100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化（熱休克法）冰上靜置23分鐘簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）?；驹恚?在一定強(qiáng)度脈沖電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生暫時性縫隙或微孔，質(zhì)粒或DNA重組分子便可由此微孔進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。特點(diǎn)： 轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法利用掃描電鏡拍攝的電穿孔照片電穿孔儀LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，4離心集菌冰冷的水重懸菌體4離心集菌冰冷的水重懸菌體4離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀0.5g質(zhì)粒DNAOn ice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37

13、 中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化操作方法定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。 例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中有108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。如果一微克pUC18共有31011個分子，也就是說，每3000個pUC18分子才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞（108/31011）。（3）轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。 例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/g載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得10

14、4個重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要： 104 /（107 100） = 0.1 g 載體DNA 考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： 0.1 / 20% = 0.5g 載體DNA 載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5g）。 重組質(zhì)粒 影響轉(zhuǎn)化率的因素載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的空載體超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。插入片段的大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入

15、片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。a、生長狀態(tài)制備感受態(tài)時菌體OD值要控制在0.30.4。b、必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。d、儲存感受態(tài)細(xì)胞要在-70以下c、CaCl2處理e、使用感受態(tài)菌時必須在冰上融化融化后一般不能再次凍存使用。 感受態(tài)細(xì)胞 （competent cells） 把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。體外包裝（in vitro packaging） 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 = 0.5左右 重組DNA通過噬菌體蛋白或病毒蛋白包裝成有感染能力的噬菌體或病毒顆粒而進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式。2、轉(zhuǎn)導(dǎo)（tran

16、sduction) 加入新鮮培養(yǎng)基，30培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選吸附 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸液，30保溫10分鐘轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解（1）擴(kuò)增操作： 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37培養(yǎng)45min1.5h，噬菌體轉(zhuǎn)染后的30培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作。（2）擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 主要是以動植物病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒及植物農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化受

17、體細(xì)胞，把外源DNA引入。優(yōu)點(diǎn)：定向性好、效率高、重復(fù)性好缺點(diǎn)：載體的侵染范圍有限二、外源基因?qū)胝婧思?xì)胞1、借助于載體的基因轉(zhuǎn)移（1）基本原理 將轉(zhuǎn)移的DNA溶液與適量CaCl2的溶液混合，再加入一定量的磷酸鹽溶液，逐步生成DNA磷酸鈣沉淀復(fù)合物。將適量的該復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過細(xì)胞的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，然后整合到染色體上，或游離于細(xì)胞質(zhì)中逐漸降解。（2）操作步驟： DNA磷酸鈣沉淀復(fù)合物的制備 沉淀復(fù)合物向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 后培養(yǎng)2、磷酸鈣共沉淀3、脂質(zhì)體（lipofectin）介導(dǎo)法 通過脂質(zhì)體與DNA靜電結(jié)合或直接將DNA包裹，并透過細(xì)胞膜把DNA運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，

18、實(shí)現(xiàn)外源基因的有效轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒。 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞攝入外源DNA。4、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖葡聚糖+DNA 吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。（1）原生質(zhì)體融合法 用酶去除微生物和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，將外源基因與原生質(zhì)體混合，在PEG（聚乙二醇）作用下使外源基因?qū)爰?xì)胞。5、其他導(dǎo)入方法（2）電穿孔法 利用外加電場，擊穿受體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使重組DNA進(jìn)入原生質(zhì)體，通過篩選、誘導(dǎo)分化獲得轉(zhuǎn)基因植株。* 要求細(xì)胞膜的破壞不會造成對細(xì)胞的致命傷害（3）基因槍法 利用被放電或機(jī)械加速的金屬微粒轟擊受體細(xì)胞，使吸附在金屬微粒表面的重組DNA一起進(jìn)入受體細(xì)胞。 （4）激光微束穿孔法