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1、實(shí)驗(yàn)五感受態(tài)的制備、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選2015-10-30實(shí)驗(yàn)安排感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化第二天,觀察結(jié)果質(zhì)粒酶切-電泳檢測(cè) 上次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物(質(zhì)粒) 酶切電泳點(diǎn)樣安排電泳上樣:1、所有同學(xué)各自的酶切產(chǎn)物(10-20 l)2、每排點(diǎn)樣孔需有兩種質(zhì)粒:pUC119、pUC119-U63、同一人的“酶切前”與“酶切后”相鄰點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管,4000rpm10min 加入冰冷CaCl2溶液300 l,重懸菌體 沉淀中加入冰冷CaCl2溶液120 l,重懸菌體感受態(tài)制備冰浴15-30min, 4000rpm10min收集沉淀,去上清收集沉淀,去上清(去掉培養(yǎng)基)實(shí)驗(yàn)步驟每管感受態(tài)中加質(zhì)粒
2、5 l,混勻42 ,熱激90秒,勿搖動(dòng)每管加LB 500 l,37搖床,復(fù)蘇30-40min 鋪200 l 菌液到LB瓊脂平板,涂勻轉(zhuǎn)化冰上靜置20-30min如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的參照體系(對(duì)照組)?篩選實(shí)驗(yàn)步驟LB培養(yǎng)基(X-gal, IPTG, Amp)LB培養(yǎng)基感受態(tài)+質(zhì)粒( pUC119-U6 or pUC119)感受態(tài)(無(wú)質(zhì)粒)pUC119-U6pUC119對(duì)照組B?對(duì)照組A?基因克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)(同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon),繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,篩選出
3、含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞,再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子,也稱(chēng)DNA克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 基因克隆示意圖基因克隆操作過(guò)程: 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)重組DNA導(dǎo)入受體菌LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O細(xì)胞膨脹:低滲環(huán)境胞膜收縮:低溫環(huán)境離子擴(kuò)散: DNA-Ca2熱休克: 42 1L LB
4、培養(yǎng)基:10g 胰蛋白胨5g 酵母提取物10g NaCl 重組體的篩選重組DNA導(dǎo)入受體菌后,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)使其大量繁殖,再設(shè)法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來(lái),這一過(guò)程即為篩選(screening)或選擇(selection)。重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue) 互補(bǔ)(藍(lán)白斑篩選)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等 互補(bǔ)的檢測(cè)藍(lán)白斑篩選感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的檢驗(yàn)1g的完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,得到的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的數(shù)量。例如,取1l(0.1 ng/l)完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100l的感受態(tài)細(xì)胞. 向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900l培養(yǎng)液,讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間,取100l鋪板.培養(yǎng)過(guò)夜,產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化0.1 ng DNA,用SOC稀釋到1000l后,取1/10涂平板,則涂平板共用0.01 ng DNA 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化率1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/g轉(zhuǎn)化效率1106 cfu/g DNA可滿(mǎn)足普通的亞克隆實(shí)驗(yàn);11
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