目的DNA片段的體外擴(kuò)增-完整版獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、 PCR擴(kuò)增目的基因【PCR 原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法，其基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程。 反應(yīng)包括: 變性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三個(gè)基本步驟。這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)2535輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。加熱變 性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性 加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱(chēng)為 DNA的變性。 解

2、除變性的條件后, 變性的單鏈可以重新結(jié)合起來(lái),形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱(chēng)DNA復(fù)性, 也叫退火。 PCR擴(kuò)增原理延伸變性、退火535335變性退火35延伸變性：加熱，使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。退火：溶液溫度降至4565，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈為模板，利用引物的3-OH，以反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，按53方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。 PCR的三個(gè)熱反應(yīng)過(guò)程溫度（）時(shí)間（min）94726094變性（1min）60

3、 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR 反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求為止。 PCR的產(chǎn)量 每一次循環(huán)后模板比前一次循環(huán)增加一倍。 DNA產(chǎn)量以指數(shù)上升，n個(gè)循環(huán)后，達(dá)到2n拷貝?！緝x器耗材與試劑】（一）儀器與耗材1. PCR熱循環(huán)儀2. 20L、 200L 吸頭，200L、500L EP管，10L、 50L、200L移液器3. PCR 電泳儀和電泳槽（二）試劑10PCR Buffer；MgCl2, 25 mmol/L； dNTP（ 其中

4、包括dATP、dCTP、dGTP與dTTP；每種濃度均為10 mmol/L ）；正向引物與反向引物（10 M/L）；Taq DNA聚合酶（1U/L）； DNA模板 （小鼠基因組DNA，100ng/L ， 反轉(zhuǎn)錄cDNA）； ddH2O 【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 在0.2 mL Eppendorff 管內(nèi)配置20 L反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積（L）dd H2O 12PCR緩沖液 （10）2MgCl2 （25 mmol/L）2dNTP （10 mmol/L ）1.0正向引物 （ 10 M/L ）0.5反向引物 （ 10 M/L ）0.5Taq DNA聚合酶 1模板DNA 12. 按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 1）

5、 94 預(yù)變性 3 min； 2） 94 變性 1 min； 3） 55 退火 30 sec； 4） 72 延伸 30 sec； 5） 重復(fù)步驟24, 34次； 6） 72 延伸 5 min； 7） 4 , 3min.3. 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 配制2瓊脂糖凝膠，取10 L擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電壓100V。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察結(jié)果。 4. PCR的反應(yīng)體系中各組分作用DNA 模板 (template)引物 (primer)4種脫氧核苷酸 （dNTP）DNA聚合酶 （Taq）反應(yīng)緩沖液Mg2+及某些使酶穩(wěn)定的輔劑質(zhì)量：要求有較高純度的DNA樣品避免反復(fù)凍融，防止降解數(shù)量: 25-10

6、0ng/20l 1）DNA 模板2）引物 與模板DNA的某個(gè)局域具有互補(bǔ)堿基特異性的短的單鏈DNA片段。3）dNTP 4種 dNTP 用量應(yīng)均衡，否則會(huì)減少 Taq 酶合成的忠實(shí)性，增加錯(cuò)配率。最初的聚合酶 大腸桿菌DNA 聚合酶 klenow 片段, 不耐熱，每次加熱變性后需重新補(bǔ)加。 聚合溫度偏低（37 ），產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增Taq DNA 聚合酶 從水生棲熱菌中分離，可在70-75生長(zhǎng)。 Taq 酶擴(kuò)增效率: 600bp/min 錯(cuò)配率: 1bp/4000bp (無(wú)3-5外切酶活性) 4）DNA聚合酶作用: 增強(qiáng)酶蛋白的穩(wěn)定性，維持酶活性。 增加 dsDNA 的 Tm 值，提高融合溫度。 與游離 dNTP 形成可溶性復(fù)合物，有利 dNTP 滲入。濃度: 1.5-2.0 mmol/l5）緩沖液中的Mg2+6）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)是2535次。 循環(huán)次數(shù)過(guò)多，產(chǎn)生平臺(tái)效應(yīng)；非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加。5. PCR反應(yīng)常見(jiàn)問(wèn)題1. 沒(méi)有任何產(chǎn)物：模板太少，模板含有大量雜質(zhì)（蛋白，酶抑制劑） 酶失活或者忘記添加 引物設(shè)計(jì)，濃度 Mg2+濃度太低變性時(shí)間太短，退火溫度過(guò)高，延伸時(shí)間太短等2. 產(chǎn)生多個(gè)條帶：引物與非目的片