選修1土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 完整版PPT

1、專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 課題背景1、尿素的利用 尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶 H2O尿素: CO(NH2)23、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌；某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌；統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。一、研究思路、篩選菌株、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目、設(shè)置對(duì)照1、實(shí)例： 尋找目的菌

2、種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物，只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。 DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。、篩選菌株 科學(xué)家在熱泉中找到了耐熱細(xì)菌Taq，并從水生耐熱細(xì)菌Taq中分離到耐高溫的Taq DNA聚合酶。 去哪里尋找這種耐高溫的DNA聚合酶？ 為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來(lái)？啟示： 利用選擇培養(yǎng)基分離。在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。實(shí)例 例1、固氮微生物：用無(wú)氮培

3、養(yǎng)基分離； 例2、酵母菌和霉菌:用含青霉素的培養(yǎng)基分離； 例3、分解尿素的細(xì)菌：用尿素是唯一氮源的培養(yǎng)基分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理： 人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。、篩選菌株方法：瓊脂 15.0g尿素CO(NH2)2 1.0g葡萄糖 10.0gMgSO47H2O 0.2gNaH2PO4 2.1g KH2PO4 1.4g3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：、篩選菌株培養(yǎng)基組成 H2O定容至1000ml3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看，此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上看，此培養(yǎng)基屬于哪類？、篩選菌

4、株在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？思考瓊脂 15.0g尿素CO(NH2)2 1.0g葡萄糖 10.0gMgSO47H2O 0.2gNaH2PO4 2.1g KH2PO4 1.4g3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：、篩選菌株培養(yǎng)基組成提供的主要營(yíng)養(yǎng) H2O定容至1000ml無(wú)機(jī)鹽碳源氮源凝固劑氫元素、氧元素碳源 固體培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 尿素是唯一氮源 培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。 不能合成脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基篩選分解尿素的微生物的原理、

5、篩選菌株1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)： 利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)：2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）常用方法：稀釋涂布平板法。原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目： 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值，可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中（設(shè)立重復(fù)組），經(jīng)涂布，培養(yǎng)，計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)

6、際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）(稀釋涂布平板法)注意事項(xiàng)、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）(稀釋涂布平板法) P22實(shí)例第一位同學(xué)稀釋度第二位同學(xué)106 （M）106 （M）1132菌落數(shù) 平板平板23021212256平均值 163 （C）討論你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，怎樣改進(jìn)？2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）(稀釋涂布平板法)每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M

7、代表稀釋倍數(shù)。、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：P22想一想，如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測(cè)每克樣品中的菌落數(shù)？ 統(tǒng)計(jì)某一稀釋度（M）下平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，最好統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板上的菌落數(shù)的平均值（C），然后按以下公式進(jìn)行計(jì)算。計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法、比濁法、膜過濾法、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：例題：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有 （ ）A. B. C. D.D涂布平板法 重量法 直接計(jì)數(shù)法 比濁法 生理指標(biāo)法 膜過濾法 是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。、設(shè)置對(duì)照： 在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的

8、稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析A同學(xué)的結(jié)果。 土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)) 是指除了被測(cè)試的條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)。1、對(duì)照實(shí)驗(yàn)2、設(shè)置對(duì)照的主要目的原因： P23實(shí)例小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣（未接種）的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。、設(shè)置對(duì)照：（一）、土壤取樣（二）、制備培養(yǎng)基二、設(shè)計(jì)實(shí)

9、驗(yàn)（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察（三）、樣品的稀釋（四）、取樣涂布（一）、土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）、制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。二、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板（三）、樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋

10、范圍相同嗎？這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。P24 土壤中的細(xì)菌總量肯定多于土壤中能分解尿素的細(xì)菌的總量，因此選用的稀釋范圍肯定不同。實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需

11、要重新實(shí)驗(yàn)。（四）、取樣涂布2、在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 1、培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察3、一般來(lái)說，在一定的培養(yǎng)條件下，（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征（包括形態(tài)、大小、隆起程度和顏色）。（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、是否有雜菌污染3、樣品的稀釋操作4、重復(fù)組的結(jié)果2、選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落1.通過對(duì)照實(shí)

12、驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)四、操作提示 無(wú)菌操作 做好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。五、課外延伸CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3 H2O脲酶細(xì)菌合成脲酶，將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)， PH升高，因此，可通過檢測(cè)PH的變化來(lái)判斷該化學(xué)

13、反應(yīng)是否發(fā)生。2、方法：1、原理：對(duì)分裂的菌種作進(jìn)一步的鑒定用生物化學(xué)方法鑒定測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。五.課外延伸鑒定大腸桿菌大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征 大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無(wú)金屬光澤本課題知識(shí)小結(jié):1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練CD3.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高