擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)

1、擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)1擬南芥（Arabidopsis thaliana）是一種模式植物，具有基因組?。?25 Mbp）、生長周期短等特點，而且基因組測序已經(jīng)完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。從遺傳學(xué)的觀點來看，基因克隆的途徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué)途徑指的是通過被克隆基因的產(chǎn)物或表現(xiàn)型突變?nèi)ミM行反向遺傳學(xué)途徑則指的是依據(jù)被克隆基因在染色體上的位置來實現(xiàn)2圖位克?。╩ap-based cloning）又稱定位克?。╬ositional cloning），1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出，用該方

2、法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無需預(yù)先知道其表達產(chǎn)物的有關(guān)信息。它是通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關(guān)系來確定突變表型的遺傳基礎(chǔ)。圖位克隆能實現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組(Col-0生態(tài)型)測序計劃的完成和各種分子標記的發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)被儲存在專門的數(shù)據(jù)庫中（表1）。34分子標記:實現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標基因連鎖的分子標記。分子標記是一個特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因，對其有效地利用即可達到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標記的篩選,其中最為常用的是簡單序列長度多態(tài)性（SSLP）,和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。5S

3、SLP：簡單序列長度多態(tài)是基于PCR的分子標記，在擬南芥基因組中有較多分布（在Col和Ler兩個生態(tài)型中，每1000bp有411個不同的序列），而且是共顯性的，它的檢測非常直接，需要設(shè)計引物來檢測假定的SSLP標記6SNP：單核苷酸多態(tài)性，它是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個核苷酸的差別，這些差別的核苷酸通常位于不編碼區(qū)域。最常見的用于檢測SNP標記的方法主要是剪切（酶解）擴增多態(tài)性序列（CAPS） ，它也是基于PCR的。7因為有了擬南芥的基因組序列和高密度的遺傳標記，圖位克隆過程就變得相對直接。從基于Col-0和Ler遺傳背景的突變體出發(fā)，我們有可能在大約一年時間內(nèi)找出與這個突變相關(guān)的基因

4、，作為作圖過程的第一步，突變體植株將和另外一個生態(tài)型（Col-0或者Ler）的植株雜交。然后播種F1代種子。在F1代植物的生長過程中，我們就有可能來對其表現(xiàn)型和基因型進行分析。F1代植物的表型的出現(xiàn)或者消失將顯示著我們所研究的突變是顯性的還是隱性的。8col0誘變繁種淘汰致死突變和不能繁殖突變篩選突變體處理Landsberg野生型 確定突變體是否是單基因突變及顯隱性突變體篩選9基因圖位克隆aaAACol-0突變體Landsberg野生型 F1aA1 2 3 4 51 2 3 4 5aAaAAAaaF2粗定位在大多數(shù)情況下，用于雜交的突變體植株是作為父本還是母本是沒有關(guān)系的。10aaaaaaaa

5、makerCol-0Ler單交換雙交換不交換不交換重組率單交換2雙交換2樣品總數(shù)100Col-0 LerCol-0 Ler 11在15個maker中，重組率最小者距目標基因最近細定位a粗定位maker細定位maker細定位maker在3個maker中，重組率最小者目標基因距該maker最近循環(huán)若干次12一般情況下能在突變兩側(cè)找到相距小于40 Kb的兩個分子標記。找到之后，就可以通過測序來找到突變基因。一種有效的方法是設(shè)計PCR引物來擴增覆蓋這40 Kb的多個重疊的500 bp的片段。將這些片段測序后拼接起來以得到整個40 Kb的序列，然后將它與野生型植物（Col-0或者Ler）的序列進行比對，

6、這就可以找到這個區(qū)域中的多個基因。從一系列侯選基因中鑒定基因是定位克隆技術(shù)的最后一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進行下列分析以確定目標基因：（1）精確定位法檢查cDNA是否與目標基因共分離；（2）檢查cDNA時空表達特點是否與表型一致；（3）測定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，以了解該基因的功能；（4）篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進行功能互補實驗，通過轉(zhuǎn)化突變體 觀察突變體表型是否恢復(fù)正?；虬l(fā)生預(yù)期的表型變化。1314存在的問題 :圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因 1.一個給定的性狀是由不止一個的基因位點控制的 2.表觀（上位）遺傳突變:一個基因在表達和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變，這是圖位克隆工程中又一個可能的復(fù)雜情況3.染色體上位點的物理和遺傳距離的比值變化是比較小的