果蔬成分生化分析

1、果蔬成分生化分析摘要：果蔬中營(yíng)養(yǎng)成分多種多樣，本實(shí)驗(yàn)以黃豆芽和綠豆芽為研究對(duì)象，對(duì)其主要營(yíng)養(yǎng)成分（維生素C含量、總糖及還原糖含量、蛋白質(zhì)含量）測(cè)定與其過(guò)氧化物酶分析都運(yùn)用了比色法，并對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)列圖表，進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明：黃豆中的主要營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)于綠豆芽含量高，但其過(guò)氧化物酶活性低于綠豆芽，這說(shuō)明其酚類(lèi)物質(zhì)代謝能力低于綠豆芽?？偟膩?lái)說(shuō)，黃豆芽和綠豆芽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都不高，但黃豆芽相對(duì)于綠豆芽營(yíng)養(yǎng)成分較高。關(guān)鍵詞：黃豆芽；綠豆芽；維生素；總糖及還原糖；蛋白質(zhì)；過(guò)氧化酶Biochemical analysis of fruit and vegetable ingredientsCollege of l

2、ife and Environmental Sciences， Class of 11 biological scienceZhang FengpingAbstract: Fruit and vegetable nutrition in variety, this experiment with bean sprouts and mung bean as the research object, the main nutrients (vitamin C content, total sugar and reducing sugar content, protein content and p

3、eroxidase isoenzyme analysis) determination by colorimetry, and the measured data column chart, carries on the contrast research.The results show that: the soybean main nutrition component relative to the high content of mung bean sprout, but its peroxidase activity below the mung bean sprouts, whic

4、h explains its phenolic metabolism than mung bean sprouts.In general, yellow bean sprouts and mung bean sprouts nutritional value is not high, but the yellow bean sprouts and mung bean sprouts nutrients relative to higher.Keyword：Yellow bean sprouts; mung bean; vitamin; total sugar and reducing suga

5、r protein; peroxidase前言 隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食物的營(yíng)養(yǎng)也更加關(guān)注，蔬菜成了大家日常飲食中必不可少的食物之一。蔬菜可提供人體所必需的多種維生素和礦物質(zhì)。豆芽也是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食物，被稱(chēng)為“活體蔬菜”。目前市場(chǎng)上主要的豆芽是黃豆芽和綠豆芽?jī)纱箢?lèi)。 黃豆蛋白質(zhì)含量雖高，但由于它存在胰蛋白酶抑制劑，使它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到限制，所以人們提倡食用豆制品。近年發(fā)現(xiàn)豆芽中含有一種干擾素生劑，能誘生干擾素，增加體內(nèi)抗生素，增加體內(nèi)抗病毒、抗癌腫的能力。另外，中意認(rèn)為綠豆芽性涼、味甘無(wú)毒，能清暑熱、調(diào)五臟、解諸毒、利尿除濕，可用于過(guò)度飲酒、濕熱郁滯、食少體倦等。日本科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，在綠

6、豆芽的發(fā)芽過(guò)程中，部分蛋白質(zhì)可分解為氨基酸，從而增加原有的氨基酸含量。其中還含有纖維素，若與韭菜同抄或涼拌，用于老年及幼兒便秘，健全又有良效。因此，本次試驗(yàn)我們把豆芽作為研究對(duì)象，對(duì)其主要營(yíng)養(yǎng)成分（維生素C、蛋白質(zhì)、總糖、還原糖）進(jìn)行分析，以此能夠得出豆芽對(duì)人體有哪些重要作用，并能很好地加以利用。并且更加深入的了解實(shí)驗(yàn)的原理及所需的實(shí)驗(yàn)方法和技巧。2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果實(shí)驗(yàn)一 果蔬中維生素C的定量測(cè)定（1）實(shí)驗(yàn)原理：2，6-二氯酚靛酚滴定法氧化型染料在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色，在酸性溶液中呈紅色。成為還原型后為無(wú)色。用氧化型染料來(lái)滴定還原型維生素C，當(dāng)?shù)沃寥窟€原型維生素C被氧化后，在稍滴一點(diǎn)呈微紅色

7、為終點(diǎn)。滴定用去染料量與樣品中還原型維生素C量成正比。（2）實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：微量滴定管及架，漏斗，濾紙，100ml錐形瓶2個(gè)，50ml量筒1個(gè)，臺(tái)秤，移液管若干，1%草酸溶液，2%草酸溶液，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，氧化型0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液（染料）（3）實(shí)驗(yàn)步驟： a、制備新鮮果蔬液：挑選豆芽，剔除爛根部分 稱(chēng)20.0g左右于研缽中 加2%草酸定容靜置10min、過(guò)濾 40ml豆芽提取液b、滴定維生素C標(biāo)準(zhǔn)液： 將染料液裝入滴定管，驅(qū)趕氣泡，調(diào)整零點(diǎn) 錐形瓶滴定中加1.0ml維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液和9ml1%草酸溶液 溶液微紅色，15s不褪色（記下染料液未滴前滴定管的讀數(shù)和滴定后的讀數(shù)）c、滴定樣品

8、液 吸取3份10.0ml樣品液放入錐形瓶中，同上操作，并記錄相應(yīng)讀數(shù)。取平均數(shù)。（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：滴定1%維生素標(biāo)準(zhǔn)液消耗染料：1.14ml，由此可算得1ml染料相當(dāng)于0.088mg維生素，即c=0.088mg滴定黃豆芽消耗染料：V1= 1.50mlCV1 W滴定綠豆芽消耗染料：V2=2.43mlCV2W每100g黃豆芽中維生素C含量：m= 100=2.64g每100g綠豆芽中維生素C含量：m= 100=4.28g實(shí)驗(yàn)二 果蔬中總糖及還原糖含量的測(cè)定（1）實(shí)驗(yàn)原理：蒽酮比色法 單糖類(lèi)遇到濃硫酸時(shí)，脫水生成糠醛衍生物，后者可與蒽酮縮合成藍(lán)綠色的化合物，當(dāng)糖的量在20-200mg范圍內(nèi)時(shí)，其呈色強(qiáng)度

9、與溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。（2）實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：分光光度計(jì)，水浴鍋，電子分析天平，電爐，100ml容量瓶1個(gè)，試管10支，玻璃漏斗，研缽，移液槍?zhuān)客埠腿菬咳舾桑焱噭?，?biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，6mol/LHCl溶液，20%NaOH溶液（3）實(shí)驗(yàn)步驟：a、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取潔凈試管6支，按表1進(jìn)行操作：表1 蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)做圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。b、樣品中還原糖的提取和測(cè)定研磨 50水浴稱(chēng)1g豆芽+水3ml(于研缽) 勻漿 全部轉(zhuǎn)入三角燒瓶包括沖洗液冷卻 過(guò)濾 低溫 保溫約0.5h取浸出的還原糖 定容至100ml 濾液

10、取10ml 稀釋冰浴中冷卻 沸水浴10min至100ml 取1ml終液 加入4ml蒽酮試劑 冷卻620nm處比色 讀取吸光值 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查詢(xún)讀取還原糖濃度。3、樣品中總糖的提取、水解和測(cè)定稱(chēng)1g豆芽+水3ml(于研缽) 研磨 勻漿 全部轉(zhuǎn)入三角燒瓶（包括沖洗液） 加入溶液6mol/L鹽酸10ml 攪拌 沸水浴0.5h 冷卻 加入20%過(guò)濾 低溫保存NaOH溶液至中性 定容至100ml 濾液 取濾液10ml稀釋至100ml 取1mL終液同上法進(jìn)行還原糖測(cè)定。（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：黃豆芽綠豆芽還原糖OD值0.1500.182總糖OD值0.1330.297 由標(biāo)準(zhǔn)曲線得，測(cè)還原糖時(shí)C1（黃豆芽）=0.0

11、21mg/ml；C2（綠豆芽）=0.025mg/ml 測(cè)總糖時(shí)C3（黃豆芽）=0.019mg/ml；C4（綠豆芽）=0.041mg/ml則W1=C1V/m100%=2.1%; W2=C2V/m100%=2.55%; W3=C3V/m100%=1.67%； W4=C4V/m100%=3.69%實(shí)驗(yàn)三 果蔬中蛋白質(zhì)含量測(cè)定（1）實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮藍(lán)法藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)

12、含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。（2）實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：分光光度計(jì)，離心機(jī)，試管8支，其余器材同上，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，考馬斯亮蘭G-250染料試劑，0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）（3）實(shí)驗(yàn)步驟：a、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取6支試管，按下表加入各試劑。 管號(hào) 試劑012345100g/ml牛血清白蛋白溶液mL00.20.40.60.81.0蒸餾水mL1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)液mL5.05.05.05.05.05.0加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄A595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白

13、質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b、樣品制備研磨 全部轉(zhuǎn)入離心管1g新鮮豆芽置于冰浴上的研缽內(nèi)+1ml水 勻漿 3500rpm高速離離心15-20min 心 取上層清液為自制蛋白質(zhì)樣品，備用c、樣品測(cè)定自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL+5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑 搖勻放置5min 595nm波長(zhǎng)下比色 讀取吸光度，并記錄 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查詢(xún)讀取蛋白質(zhì)含量（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：黃豆芽綠豆芽OD值0.2940.153由標(biāo)準(zhǔn)曲線得，m（綠豆芽）=27.45=137g m（黃豆芽）=52.95=264.5g實(shí)驗(yàn)四 果蔬中過(guò)氧化物酶分析（一）過(guò)氧化物同工酶的分離（1）實(shí)驗(yàn)原理：聚丙烯酰胺

14、凝膠電泳凝膠電泳具有一般電泳的電場(chǎng)效應(yīng)，即在一定pH的溶液中，樣品分子由于解離或吸附，使自身帶一定的電量，在相同的電場(chǎng)強(qiáng)度作用下，不同的樣品分子因帶不同的電性和電量，電泳時(shí)具有不同的泳動(dòng)速度，使最終的遷移距離不同而分離。凝膠電泳與其他電泳的重要區(qū)別是它除了有電場(chǎng)效應(yīng)外，還具有分子篩效應(yīng)，因凝膠是一種立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，樣品分子在通過(guò)凝膠網(wǎng)孔時(shí)受摩擦力等的作用，使體積小、形狀為圓球形的樣品分子受到的阻力小，移動(dòng)較快，而體積大，形狀不規(guī)則的樣品分子受阻力大，移動(dòng)較慢。因此，凝膠電泳不但從分子帶電情況的差別，而且還從分子大小、形狀方面的差別來(lái)分離樣品分子，具有很高的分辨力。（2）實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：垂直

15、板電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導(dǎo)線管），直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，移液槍?zhuān)咚匐x心機(jī)，大培養(yǎng)皿，量筒和燒杯若干，A（分離膠緩沖液），B（濃縮膠緩沖液），C（分離膠貯液），D（濃縮膠貯液），E 核黃素，F(xiàn) 蔗糖，電極緩沖液(用時(shí)稀釋10倍)，封板膠（加熱煮沸），樣品提取液（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.6），染色液，前沿指示劑（3）實(shí)驗(yàn)步驟：貯液配制（實(shí)驗(yàn)室提供）b、電泳槽安裝去污直立干燥 兩塊玻璃板 裝入硅膠條中，垂直固定在電泳槽上（按對(duì)角線順序旋緊螺絲）周邊用1.5的瓊脂密封 安裝完畢凝膠制備（A、B、C、D、E、F分別代表的溶液可從試劑2.2中得知）按下表配置分離膠A3mlC6m

16、l0.14%過(guò)硫酸銨12ml水3mlTEMED15l（分離膠沿玻板加入膠室內(nèi)，避免氣泡產(chǎn)生，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋2-3mm水層，靜置待膠與水層的界面重新出現(xiàn)時(shí)，表明膠已經(jīng)聚合）按下表配置濃縮膠B1.5mlD3mlE1.5mlF6mlTEMED18l（TEMED在灌膠前加，或灌膠后都得放在黑暗環(huán)境中。倒掉分離膠水層 吸水紙吸干 立即加濃縮膠，插入梳子 凝膠后 取梳子，稀釋十倍的點(diǎn)擊緩沖液倒入槽中：短板側(cè)緩沖液沒(méi)過(guò)樣品槽，長(zhǎng)板緩沖液沒(méi)過(guò)電極。備用。）樣品制備取40l樣液和8l上級(jí)緩沖液混合，留作點(diǎn)樣用。點(diǎn)樣用微量注射器（50l）吸取少量樣液，在濃縮膠上層點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)樣槽15-50l

17、。電泳接好電源線（前槽為負(fù)極）。電源打開(kāi)，調(diào)節(jié)電流到20mA左右，樣品進(jìn)入到分離膠后染色、記錄結(jié)果加大到30mA，維持恒流。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，電泳結(jié)束。關(guān)閉電源，該過(guò)程大約2小時(shí)。剝膠取電泳膠板，去膠套，掀開(kāi)玻璃，去濃縮膠，放入培養(yǎng)皿。染色、記錄結(jié)果把配置好的染色液倒入培養(yǎng)皿，室溫下1-10min左右后顯示藍(lán)色條帶，后變紅褐色。用去離子水漂洗，并拍照記錄。(4) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果黃豆芽：同工酶移動(dòng)距離cm1.101.152.653.104.104.35移動(dòng)率0.1830.1920.4420.5170.6830.725移動(dòng)終點(diǎn)：6.00cm綠豆芽：同工酶移動(dòng)距離

18、cm1.051.201.651.952.704.45移動(dòng)率0.1690.1940.2660.3150.4350.718移動(dòng)終點(diǎn)：6.20cm(二) 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定（1）實(shí)驗(yàn)原理：比色法 化氫存在下，過(guò)氧化氫酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測(cè)量470nm的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。（2）實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋，100ml容量瓶，離心機(jī)，比色皿若干，0.1mol /L 磷酸緩沖液pH7.6，反應(yīng)混合液（實(shí)驗(yàn)室已配制）（3）實(shí)驗(yàn)步驟：a、把上次蛋白質(zhì)含量測(cè)定試驗(yàn)中制得的貯液從冰箱中拿出做為該次實(shí)驗(yàn)的材料b、 一只加反應(yīng)

19、混合液3ml+磷酸緩沖液1ml 取光徑1cm比色杯3只 一只加反應(yīng)混合液3ml+磷酸緩沖液1ml+黃豆芽酶液1ml 一只加反應(yīng)混合液3ml+磷酸緩沖液1ml+綠豆芽酶液1ml分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)470nm下吸光值 連續(xù)5min，取平均值開(kāi)啟秒表，每隔1min讀一次（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：01min2min3min4min5min對(duì)照組0.0000.0000.0000.0000.0000.000黃豆芽3.3653.2923.2013.1043.1203.181綠豆芽1.1182.7663.0943.0933.0773.143OD470nm 0.01t黃豆芽OD470nm=0.068過(guò)氧化物酶活力 = D=

20、6.80OD470nm 0.01wt過(guò)氧化物酶比活力 = D=6.80 u/（gmin）OD470nm0.01t綠豆芽OD470nm=0.412過(guò)氧化物酶活力 = D =41.20OD470nm 0.01wt 過(guò)氧化物酶比活力 = D =41.20 u/（gmin）3.實(shí)驗(yàn)分析及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果中黃豆芽和綠豆芽的維生素含量都不是很高，可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有不當(dāng)之處。測(cè)定過(guò)程采用的是用氧化型2，6-二氯酚靛酚氧化滴定維生素C，滴定用去氧化型2，6-二氯酚靛酚與樣品中還原型維生素C量成正比。而還原型維生素C又易被空氣中的氧氣所氧化，由于該實(shí)驗(yàn)在蘋(píng)果研磨時(shí)花費(fèi)時(shí)間較大，導(dǎo)致大部分還原型維生素C在滴定前就被氧氣氧化，滴定所用的氧化型2，6-二氯酚靛酚減少，因此所測(cè)得樣品中維生素C含量不高。正常情況下，黃豆芽中維生素C的含量應(yīng)高于綠豆芽，但在本次實(shí)驗(yàn)中結(jié)果恰好相反，可能的原因是a 黃豆芽的豆瓣較大，研磨時(shí)難以研磨成勻漿，使豆瓣中的大量維生素C沒(méi)有完全進(jìn)入樣品液中；b 在轉(zhuǎn)