生化技術(shù)知識整理課件

1、生化技術(shù)知識整理生化技術(shù)知識整理2022/9/9當(dāng)試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或吸附隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進行。2022/9/5當(dāng)試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接觸時，被2022/9/9分配系數(shù) K 組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，用K 表示，即：2022/9/5分配系數(shù) K 組分在固定相和流動2

2、022/9/9分配系數(shù) K的討論 一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K = 0時，即不被固定相保留，最先流出。2022/9/5分配系數(shù) K的討論 一定溫度下，組分的分配系2022/9/92.色譜法分類 氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。 按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜； 按固定相的不同又分為：氣-固色譜和氣-液色譜2022/9/52.色譜法分類 氣相2022/9/9 3 氣相色譜基本概念（1）有關(guān)色譜圖的定義色譜

3、圖：檢測器響應(yīng)信號隨時間變化的曲線。也叫流出曲線?；€：沒有進樣時，只有載氣通過檢測器，記錄儀記下的曲線。色譜峰：色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的信號曲線。峰底：連接峰起點到終點間的距離。2022/9/5 3 氣相色譜基本概念（1）2022/9/9峰高：流出曲線最大值到峰底的距離。峰寬（W）：峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點間的距離。半峰寬（W1/2）：峰高一半處峰的寬度。峰面積（A）：峰與峰底圍成的面積。保留時間（tr）：組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值時所需時間。2022/9/5峰高：流出曲線2022/9/9氣相色譜流出曲線1).基線 無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2).保留值 （1

4、）時間表示的保留值保留時間（tr）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的 時間 死時間（tr0）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時 間。 調(diào)整保留時間（tr ）：tr= trtr0 2022/9/5氣相色譜流出曲線1).基線保留時間（tr）：2022/9/9續(xù)色譜曲線的用途：（1）根據(jù)色譜峰的位置（保留值）可以進行定性的分析.（2）根據(jù)色譜峰的面積可以進行定量分析.（3）根據(jù)色譜峰的位置及其寬度，可以對色譜柱分離情況進行評價。2022/9/5續(xù)色譜曲線的用途：2022/9/9兩相鄰組分在不同色譜條件下的分離情況：(a) 兩峰間僅有一定的距離，而每個峰卻很寬，致使彼此重疊，兩組分不能完全

5、分離。（b)兩峰間有既有一定的距離，且每個峰卻很窄，致使彼此峰不重疊，兩組分能完全分離。續(xù)2022/9/5兩相鄰組分在不同色譜條件下的分離情況：續(xù)2022/9/94、氣相色譜流程1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；7-進樣器;8-色譜柱;9-熱導(dǎo)檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；1. 載氣系統(tǒng)：包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制;2. 進樣系統(tǒng)：進樣器及氣化室；3. 色譜柱：填充柱（填充固定相）或毛細管柱（內(nèi)壁涂有固定液）；4. 檢測器：可連接各種檢測器，以熱導(dǎo)檢測器或氫火焰檢測器最為常見；5. 記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理儀

6、；6. 溫度控制系統(tǒng)：柱室、氣化室的溫度控制。氣相色譜的組成:2022/9/54、氣相色譜流程1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；12022/9/9 1) 氣固色譜固定相種類： 活性炭：有較大的比表面積，吸附性較強。 活性氧化鋁：有較大的極性。適用于常溫下O2、N2、CO、CH4、C2H6、C2H4等氣體的相互分離。CO2能被活性氧化鋁強烈吸附而不能用這種固定相進行分析。 硅膠：與活性氧化鋁大致相同的分離性能，除能分析上述物質(zhì)外，還能分析CO2、N2O、NO、NO2等，且能夠分離臭氧。固定相及其選擇5、色譜柱及使用條件的選擇2022/9/5 1) 氣固色譜固定相種類：固定相及其選擇52022/9/9 分

7、子篩： 堿及堿土金屬的硅鋁酸鹽（沸石），多孔性。如3A、4A、5A、10X及13X分子篩等（孔徑：埃）。 高分子多孔微球（GDX系列）： 新型的有機合成固定相（苯乙烯與二乙烯苯共聚）。 型號：GDX-01、-02、-03等。適用于水、氣體及低級醇的分析。2022/9/5 分子篩：2022/9/92)氣-液色譜固定相 氣液色譜固定相 固定液+擔(dān)體（支持體） ： 固定液在常溫下不一定為液體，但在使用溫度下一定呈液體狀態(tài)。 固定液的種類繁多，選擇余地大，應(yīng)用范圍不斷擴大。擔(dān)體：化學(xué)惰性的多孔性固體顆粒，具有較大的比表面積。 2022/9/52)氣-液色譜固定相 氣液色2022/9/9擔(dān)體（硅藻土）紅

8、色擔(dān)體： 孔徑較小，表孔密集，比表面積較大，機械強度好。適宜分離非極性或弱極性組分的試樣。 缺點: 是表面存有活性吸附中心點白色擔(dān)體： 煅燒前原料中加入了少量助溶劑(碳酸鈉)。顆 粒疏松，孔徑較大。表面積較小，機械強度 較差。但吸附性顯著減小，適宜分離極性組分的試樣。2022/9/5擔(dān)體（硅藻土）紅色擔(dān)體：2022/9/9C 固定液分類方法 如按化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、應(yīng)用等的分類方法。在各種色譜手冊中，一般將固定液按有機化合物的分類方法分為：脂肪烴、芳烴、醇、酯、聚酯、胺、聚硅氧烷等.2022/9/5C 固定液分類方法 如按化學(xué)結(jié)2022/9/9D、固定液的選擇按極性相似原則選擇：固定液與被測組分極

9、性“相似相溶”，K大，選擇性好 （1）分離非極性組分選非極性固定液， 按沸點順序出柱，低沸點的先出柱，沸點高后出柱。（2）分離極性組分選極性固定液，按極性順序出柱，極性小的先流出色譜柱，極性強的后出柱。（3）分離非極性和極性的混合組分選極性固定液，按極性順序出柱，非極性組分的先流出色譜柱，極性組分的后出柱。（4）對于能形成氫鍵的試樣，應(yīng)選用極性或氫鍵型固定液，此時各組分按形成氫鍵的能力大小順序分離。不易形成氫鍵的先流出，最易形成氫鍵的最后流出。 2022/9/5D、固定液的選擇按極性相似原則選擇：固定液與2022/9/9E. 固定液配比（涂漬量）的選擇 配比：固定液在擔(dān)體上的涂漬量，一般指的是

10、固定液與擔(dān)體的百分比，配比通常在5%25%之間。 配比越低，擔(dān)體上形成的液膜越薄，傳質(zhì)阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。 配比較低時，固定相的負載量低，允許的進樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。2022/9/5E. 固定液配比（涂漬量）的選擇 配比2022/9/9 柱長和柱內(nèi)徑的選擇 增加柱長對提高分離度有利（分離度R正比于柱長L2），但組分的保留時間tr ，且柱阻力，不便操作。 柱長的選用原則是在能滿足分離目的的前提下，盡可能選用較短的柱，有利于縮短分析時間。 填充色譜柱的柱長通常為13米，內(nèi)徑34厘米。2022/9/5 柱長和柱內(nèi)徑的選擇 增加柱長2022/9/9柱溫的確定

11、(1) 首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度（超過該溫度固定液易流失）和最低使用溫度（低于此溫度固定液以固體形式存在）范圍之內(nèi)。 (2) 柱溫升高，分離度下降，色譜峰變窄變高。柱溫，分離度，分析時間. (3)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點時的溫度。 (4)組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。2022/9/5柱溫的確定 (1) 首先應(yīng)使柱溫控制在固2022/9/9載氣種類和流速的選擇1) 載氣種類的選擇 (1)載氣摩爾質(zhì)量大，可抑制試樣的縱向擴散，提高柱效。 (2)載氣流速較大時，傳質(zhì)阻力項起主要作用，采用較小摩爾質(zhì)量的載氣（如H2，He），可減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。 (3)熱導(dǎo)檢測

12、器需要使用熱導(dǎo)系數(shù)較大的氫氣有利于提高檢測靈敏度。在氫焰檢測器中，氮氣仍是首選目標(biāo)。 (4)在載氣選擇時，還應(yīng)綜合考慮載氣的安全性、經(jīng)濟性及來源是否廣泛等因素。2)載氣流量以3080ml/min較為合適.2022/9/5載氣種類和流速的選擇1) 載氣種類的選擇2022/9/9其它操作條件的選擇1）進樣方式和進樣量的選擇 液體試樣采用色譜微量進樣器進樣，規(guī)格有1L，5L，10L等。進樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內(nèi)。進樣要求動作快、時間短。氣體試樣應(yīng)采氣體進樣閥進樣。2022/9/5其它操作條件的選擇1）進樣方式和進樣量的選擇2022/9/92）氣化溫度的選擇 色譜儀進樣口下端

13、有一氣化器，液體試樣進樣后，在此瞬間氣化; 氣化溫度一般較柱溫高3070 防止氣化溫度太高造成試樣分解。2022/9/52）氣化溫度的選擇2022/9/96、氣相色譜檢測裝置濃度型檢測器： 測量的是載氣中通過檢測器組分濃度瞬間的變化，檢測 信號值與組分的濃度成正比。如熱導(dǎo)池檢測器、電子捕獲檢測器等。 質(zhì)量型檢測器： 測量的是載氣中某組分進入檢測器的速度變化，即檢測信號值與單位時間內(nèi)進入檢測器組分的質(zhì)量成正比。如氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器等。2022/9/56、氣相色譜檢測裝置濃度型檢測器：2022/9/9檢測器的性能指標(biāo) 一個優(yōu)良的檢測器應(yīng)具以下幾個性能指標(biāo)：響應(yīng)迅速，靈敏度高，檢出限

14、低，死體積小，線性范圍寬，穩(wěn)定性好。通用性檢測器要求適用范圍廣；選擇性檢測器要求選擇性好。并以這些作為檢測器的性能指標(biāo)。2022/9/5檢測器的性能指標(biāo) 一個優(yōu)良的檢測器應(yīng)具以下幾2022/9/97.氣相色譜法的特點（1）分離效率高： 復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2） 靈敏度高： 可以檢測出g.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量.（3） 分析速度快： 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4） 應(yīng)用范圍廣： 適用于沸點低于400的各種有機或無機試樣的分析。 不足之處： 不適用于高沸點、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。 被分離組分的定性較為困難。

15、2022/9/57.氣相色譜法的特點（1）分離效率高：2022/9/98 氣相色譜分析的應(yīng)用范圍氣相色譜法應(yīng)用對象:氣體試樣，也可以分析易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的液體或固體，不僅可以分析有機物，也可以分析部分無機物。一般說來，只要沸點在500以下，熱穩(wěn)定性良好，相對分子量在400以下的物質(zhì)，原則上都可以用氣相色譜分析法。2022/9/58 氣相色譜分析的應(yīng)用范圍氣相色譜法應(yīng)用對2022/9/9 3、簡要說明氣相色譜分析的基本原理4、氣相色譜儀的基本設(shè)備包括哪幾部分?各有什么作用?5、氣相色譜法的優(yōu)缺點。 思 考 題1、名詞解釋：氣相色譜法、載氣、擔(dān)體、峰面積、保留時間、死時間2、請你簡述氣相色譜法的基本過程。2022/9/5 2、請你簡述氣相色譜法的基本過程。2022/9/9氣相色譜就是：流動相為氣體的、借在兩相間分配原理而使混合物中各組分分離。根據(jù)組分與固定相與流動相的親和力不同而實現(xiàn)分離。組分在固定相與流動相之間不斷進行溶解、揮發(fā)（氣液色譜），或吸附、解吸過程而相互分離，然后進入檢測器進行檢測。載氣：氣象色譜法中的氣體流動相擔(dān)體：化學(xué)惰性的多孔性固體顆粒，具有較大的比表面積，是氣象色譜法中固定相中的支持體。峰面積（A）：峰