高通量測(cè)序在臨床精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用

1、高通量測(cè)序（NGS）在臨床精準(zhǔn)診療中應(yīng)用第1頁(yè)高通量測(cè)序成本快速下降第一次人類基因組測(cè)序耗時(shí)，成本30億美元，到11月，基因組測(cè)序僅需一兩周，花費(fèi)10萬(wàn)美元。新一代儀器可將全基因組序列測(cè)序成本降到1000美元以下，成本不足第一代百萬(wàn)分之一。而且伴隨技術(shù)進(jìn)步，仍在不停下降。成本快速下降，測(cè)序領(lǐng)域超摩爾定律助推臨床應(yīng)用第2頁(yè)測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)實(shí)狀況3第一代（穩(wěn)定需求）ABi3130 xL(FDA CFDA)3730 xL3500 xL（FDA CFDA）第三代Life Technologies (ABi)Ion Torrent PGMHelicos BiosciencesHelicos Genetic

2、 Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem 第二代（高速發(fā)展）RocheGenome Sequencer FLX System GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq HiSeq 2500Life Technologies (ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemDanaherMotionPolonator G.007Complete Genomics無(wú)錫艾吉因生物信息技術(shù)有限企業(yè)AG-100深圳華因康基因科技有限企

3、業(yè)（CFDA）Pstar-1中科院北京基因組所/半導(dǎo)體所BIGIS-1BIGIS-4第3頁(yè)各類高通量測(cè)序技術(shù)原理第4頁(yè)高通量測(cè)序技術(shù)在臨床中主要應(yīng)用范圍出生缺點(diǎn)相關(guān)分子診療中應(yīng)用無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用（NIPT）染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用（CNV-seq）胚胎植入前遺傳學(xué)篩查領(lǐng)域中應(yīng)用（PGS）腫瘤相關(guān)分子診療中應(yīng)用遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（Germ line）腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）液態(tài)活檢（Liquid Biopsy）第5頁(yè)出生缺點(diǎn)防治，任重而道遠(yuǎn)?！?據(jù)預(yù)計(jì)，當(dāng)前我國(guó)出生缺點(diǎn)發(fā)生率在5.6%左右,每年新增出生缺點(diǎn)數(shù)約90萬(wàn)例。出生缺點(diǎn)不但影響兒童生命健康和生活質(zhì)量，而且影響整個(gè)國(guó)

4、家人口素質(zhì)和人力資源健康存量，影響經(jīng)濟(jì)社會(huì)健康可連續(xù)發(fā)展?！?中國(guó)出生缺點(diǎn)防治匯報(bào)（）第6頁(yè)新生兒萬(wàn)出生缺點(diǎn)嬰兒100萬(wàn)6染色體疾病10單基因疾病 3040多基因疾病11智力障礙2030各種畸形染色體核型發(fā)病率唐氏綜合征47，+211/700愛(ài)德華氏綜合征47，+181/3000帕陶氏綜合征47，+131/10000特納綜合征45，XO1/3000活產(chǎn)女嬰克氏綜合癥47，XXY1/1000活產(chǎn)男嬰出生缺點(diǎn)分為染色體疾病、單基因和多基因疾病第7頁(yè)NGS在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用（NIPT）第8頁(yè)NIPT科學(xué)基礎(chǔ) 血漿游離胎盤DNA胎兒游離DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA

5、）Lancet.1997胎盤起源母體外周血含有cffDNA，幾乎全部起源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。檢出時(shí)限懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。12第9頁(yè)無(wú)創(chuàng)取樣 - 抽血孕周范圍廣 12周到26周質(zhì)控輕易 不依賴孕婦年紀(jì)孕周等原因、輕易建立標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)規(guī)范不受上一胎影響NIPT相較臨床常見(jiàn)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)檢測(cè)技術(shù) 檢測(cè)孕周描述血清學(xué)篩查（唐氏篩查） 10-12周； 16周左右5%假陽(yáng)性率；20%-40%漏診率絨毛膜取樣 10-13+6周侵入性；有一定流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)羊水穿刺 16-20+6周侵入性；有一定流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)臍靜脈血穿刺 20-28周侵入性 ；有一定流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT） 12-26周非

6、侵入性，安全；準(zhǔn)確率99%以上第10頁(yè)多國(guó)出臺(tái)NIPT指南國(guó)際專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)表NIPT指導(dǎo)意見(jiàn)美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（ ACOG）和美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（SMFM）美國(guó)遺傳學(xué)咨詢協(xié)會(huì)（NSGC）國(guó)際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)（ISUOG）國(guó)際產(chǎn)前診療協(xié)會(huì)（ISPD）加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)（SOGC）美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）意大利母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì) 美國(guó)都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）認(rèn)證機(jī)制，無(wú)FDA同意企業(yè) ACAOG 0626第11頁(yè).1.15 衛(wèi)計(jì)委婦幼司我國(guó)NIPT臨床應(yīng)用政策法規(guī)目標(biāo)：完善技術(shù)規(guī)范明確在孕產(chǎn)婦人群中適用范圍界定其在整體

7、產(chǎn)前篩查與診療服務(wù)體系中合理定位規(guī)范服務(wù)流程提升服務(wù)質(zhì)量和管理水平高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查與診療技術(shù)規(guī)范（試行）第12頁(yè)NIPT臨床質(zhì)量控制21三體綜合征99%18三體綜合征97%13三體綜合征90%檢出率復(fù)合假陽(yáng)性率不高于0.5%假陽(yáng)性率復(fù)合陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不低于50%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值復(fù)合假陰性率約為0.3%假陰性率胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫不足胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象是因?yàn)榘l(fā)育造成，機(jī)制主要是受精卵發(fā)育早期染色體糾正，在正常孕婦群體里發(fā)生率約千分之1-5，是nipt假陽(yáng)性發(fā)生主要原因。這種現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域（pgs）也存在，詳細(xì)指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生百分比要比孕期cpm高，大約1

8、-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，詳細(xì)數(shù)字還沒(méi)有共識(shí)。第13頁(yè)NIPT未來(lái)發(fā)展空間大測(cè)序深度染色體非整倍體 唐氏綜合征、愛(ài)德華氏綜合征、等染色體微缺失微重復(fù)綜合征 Digeorge綜合征、貓叫綜合征、等單基因病 耳聾、地中海貧血、苯丙酮尿癥、等AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATG第14頁(yè)NGS在染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用（CNV-seq）第15頁(yè)染色體疾病結(jié)構(gòu)異常缺失、重復(fù)非平衡易位環(huán)狀、等臂等數(shù)目異常多倍體非整倍體CNV-Seq應(yīng)用領(lǐng)域流產(chǎn)原因查找產(chǎn)前（羊水、臍血）檢測(cè) 不孕不育原因查找染色體疾病先證者染色體異常檢測(cè)第16頁(yè)CNV-Seq技術(shù)操作流程第17頁(yè)CN

9、V-Seq針對(duì)人群產(chǎn)前診療：含有染色體疾病家族病史夫婦死胎、重復(fù)性流產(chǎn)，需要查明原因夫婦曾經(jīng)生育有出生缺點(diǎn)患兒孕婦染色體核型分析結(jié)果為正常，但超聲顯示結(jié)構(gòu)異常胎兒及其父母胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩先證者遺傳病診療：染色體核型分析正常，但臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力低下、自閉、各種畸形、生育障礙等患者及其父母其它醫(yī)學(xué)檢測(cè)為染色體疾病，需要確診患者第18頁(yè)NGS在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中應(yīng)用（PGS)第19頁(yè)P(yáng)GS臨床流程第20頁(yè)檢測(cè)內(nèi)容：全部染色體非整倍體大于4Mb新發(fā)染色體微缺失/微重復(fù)大于1Mb遺傳自父母染色體微缺失/微重復(fù)使用范圍:高齡患者（35歲）有重復(fù)流產(chǎn)史患者（自然流產(chǎn)3次）重復(fù)胚胎種植失敗患者（失

10、敗3次）生育過(guò)染色體異?；純悍驄D本身染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常夫婦嚴(yán)重男性不育（SMF），少弱精子癥、畸精癥自愿接收胚胎染色體異常排查夫婦PGS檢測(cè)內(nèi)容及適用范圍第21頁(yè)對(duì)NGS在PGS應(yīng)用思索高靈敏NGS技術(shù)測(cè)序環(huán)境防污染系統(tǒng)建立 單細(xì)胞測(cè)序 操作者脫落細(xì)胞污染？樣本與植入物一致性問(wèn)題 胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫不足胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域（PGS）也存在，詳細(xì)指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生百分比大約1-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，詳細(xì)數(shù)字還沒(méi)有共識(shí)。注冊(cè)審批難度 1)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制 2)臨床試驗(yàn)難點(diǎn)?第22頁(yè)NGS在腫瘤分子診療中應(yīng)用*每10萬(wàn)人發(fā)病人數(shù) *每10萬(wàn)

11、人死亡人數(shù)數(shù)據(jù)起源：全國(guó)腫瘤登記中心中國(guó)腫瘤登記年報(bào)前十大腫瘤發(fā)病占腫瘤整體發(fā)病百分比76.39%前十大腫瘤死亡占腫瘤整體發(fā)病百分比84.27%發(fā)病率*每年新發(fā)3,120,000人死亡率*每年死亡2,700,000人肺癌，54人胃癌，36人結(jié)直腸癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲狀腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人結(jié)直腸癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人腦癌，4人淋巴癌，4人第23頁(yè)各種臨床腫瘤分子診療需求全方面基因檢測(cè)各種樣本類型可進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)靶向用藥相關(guān)基因化療用藥相關(guān)基因腫瘤易感性相關(guān)基因檢測(cè)腫瘤

12、發(fā)生相關(guān)基因檢測(cè)血液樣本小標(biāo)本組織樣本大標(biāo)本組織樣本準(zhǔn)確定量第24頁(yè)遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（Germ line）臨床應(yīng)用：檢測(cè)各種腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)；檢測(cè)腫瘤基因型，判定家系組員患病風(fēng)險(xiǎn)；指導(dǎo)腫瘤個(gè)性化治療?？蒲袘?yīng)用快速、低成本探索腫瘤相關(guān)基因突變；若采取毛細(xì)管測(cè)序技術(shù)，一次只能檢測(cè)一條DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA樣本。、茱莉 BRCA1陽(yáng)性針對(duì)腫瘤基因外顯子或SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行NGS檢測(cè)。第25頁(yè)腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）肺癌Lung結(jié)腸癌Colon黑色素瘤Melanoma胃癌Gastric卵巢癌OvarianEGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITP

13、DGFRAAKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTENCTNNB1MAP2K1EGFRp53METNRASFBXW7METNRASIndustry GuidelinesEmerging and Clinical Trials 指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化治療第26頁(yè)很多腫瘤患者無(wú)法進(jìn)行活檢或手術(shù)；穿刺受檢者嚴(yán)重不適感；穿刺本身臨床風(fēng)險(xiǎn)；取材時(shí)間點(diǎn)受限，極難進(jìn)行屢次取樣；腫瘤異質(zhì)性?；诮M織腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)不足第27頁(yè)液態(tài)活檢(L

14、iquid Biopsy)Speicher M R, Pantel K. Tumor signatures in the bloodJ. Nature biotechnology, , 32(5): 441-443.循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating tumor cells, CTCs)游離腫瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)當(dāng)前看，ctDNA更適合做液態(tài)活檢第28頁(yè)作為無(wú)法獲取組織標(biāo)本補(bǔ)充，無(wú)創(chuàng)取樣后檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，預(yù)測(cè)耐藥及復(fù)發(fā) 提升全程管理水平指導(dǎo)用藥實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)循環(huán)而勻質(zhì)血液標(biāo)本，在一定程度有效克服異質(zhì)性勻質(zhì)標(biāo)本未來(lái)可用ctDNA血液檢測(cè)進(jìn)行突變狀態(tài)動(dòng)態(tài)耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)第29頁(yè)腫瘤類型繁多，分子突變特點(diǎn)不一；高靈敏度定性、定量檢測(cè)，技術(shù)分辨率要求高；ctDNA起源復(fù)雜，不一樣腫瘤患者個(gè)體差異較大，數(shù)據(jù)解讀與注釋需慎重；當(dāng)前仍局限于晚期腫瘤臨床應(yīng)用；需要大規(guī)模、多中心臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)。ctDNA檢測(cè)技術(shù)面臨挑戰(zhàn)第30頁(yè)對(duì)NGS在腫瘤應(yīng)用思索腫瘤風(fēng)險(xiǎn)易感基因檢測(cè)對(duì)診療價(jià)值？ 數(shù)據(jù)庫(kù)積累？預(yù)測(cè)精準(zhǔn)性？ 23and me？11月26日，F(xiàn)DA叫停 健康基因檢測(cè)服務(wù)。 年3月：同意其布盧姆綜合癥基因攜帶者檢測(cè)服務(wù)(一個(gè)隱性遺傳病)。 BRCA1、BRCA2-乳腺癌易感基因，藥品靶點(diǎn)（奧拉帕尼）2. 腫瘤相關(guān)