旋光光譜和圓二色譜

1、旋光光譜和圓二色譜 旋光光譜（optical rotatory dispersion， ORD） 圓二色譜（circular sichroism， CD） 分別于20世紀5060年代發(fā)展起來的儀器分析方法，都是利用電磁波和手性物質(zhì)相互作用的信息來研究化合物的立體結(jié)構(gòu)及其它有關(guān)問題。1 偏振光與手性物質(zhì)的相互作用 旋光光譜 圓二色譜 康頓效應及ORD、CD和UV間的關(guān)系 應用 注意事項2 1、光的偏振態(tài)（1）自然光與線偏振光（或平面偏振光）普通光源中的原子和（或）分子能夠獨立發(fā)光，所發(fā)出的光 波中具有各個方向的光矢量，在與傳播方向相垂直的平面 內(nèi)，在所有可能的方向上，E的振幅都相等自然光如果光矢

2、量只在一個固定的平面內(nèi)，并沿一個固定方向振 動線偏振光或平面偏振光光矢量的振動方向與光的傳播方向所構(gòu)成的平面振動面一、偏振光與手性物質(zhì)的相互作用3（2）圓偏振光振幅保持不變，而方向周期變化，電場矢量繞傳播方向螺旋前進4 可看成是兩個相互垂直的振幅相等、相位差為/2的線偏振光的合成 /2對應于右旋圓偏振光 /2對應于左旋圓偏振光即圓偏振光中包含著兩個頻率和振幅相同的左旋和右旋圓偏振光52、偏振光的獲得（1）布儒斯特定律 入射角為0時 反射光與折射光相互垂直，此時0為布儒斯特角或起偏角，反射光為線偏振光 若自然光從空氣射到折射率為1.50的玻璃上，起偏角為56.3，折射角為33.7。6（2）晶體的

3、雙折射現(xiàn)象 當自然光射入雙折射晶體時，兩束折射光o和e都是線偏振光，并且它們的振動面通常接近于相互垂直7（3）二向色性晶體 有些透明晶體不僅具有雙折射現(xiàn)象，而且對o光和e光有不同的吸收作用，這種晶體稱為二向色性晶體，如電氣石晶具有很強的二向色性，硫酸碘奎寧晶體（4）波片也稱波晶片或相位延遲片 若讓線偏振光的振動面與1/4波片的光軸成45角，則分解后的o光和e光振幅相等，從晶片的另一表面出射的光則是圓偏振光。83、圓偏振光在手性介質(zhì)中傳播時的特點：（1）左、右旋圓偏振光在手性介質(zhì)中的傳播速度不等，導致透射出的面偏振光與入射角成一角，表現(xiàn)出旋光。9（2）手性介質(zhì)對兩種圓偏振光的吸光強度不同，由它們

4、合成的出射光不再是一個平面的偏振光，而是一個右旋或左旋的橢圓偏振光。10 二、旋光光譜（ORD）1、當平面偏振光通過手性物質(zhì)時，偏振面會發(fā)生旋轉(zhuǎn)，即該物 質(zhì)具有旋光性，旋轉(zhuǎn)的角度旋光度 2、原理（1）介質(zhì)為對稱結(jié)構(gòu)時，左右旋圓偏振光的傳播速度相同， 則它們的折射率n相等 因nc/ c:真空中光速 :介質(zhì)中光速 n=nL-nR=0 偏振面保持不變（2）介質(zhì)為不對稱結(jié)構(gòu)時，nLnR n 0 偏振面發(fā)生旋轉(zhuǎn)，隨光程增大而增大旋光現(xiàn)象113、測定儀器124、旋光度：實比旋光度：D(實/cl)100通常用鈉光D線(589.3nm)測量實l:試樣槽厚度（dm）c:100ml溶劑中溶液的g數(shù)不同波長的(比旋

5、光度)為縱坐標， 為橫坐標可得ORD光譜 :摩爾比旋光度，常用其代替 = Mr/100(度cm2dmol-1) Mr:待測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量13三、圓二色譜1、手性物質(zhì)對組成平面偏振光的左、右旋圓偏振光的吸光度不同，即L R 這種現(xiàn)象為圓二色性CD譜： 為縱坐標，為橫坐標:摩爾橢圓度，常用其代替兩者關(guān)系:=3300 =3300(L - R)142、 的物理意義 當平面偏振光通過手性介質(zhì)時，不僅左、右旋圓偏振光的傳播速度不同，而且強度也不同。用箭頭的長短代替強度。因而光在傳播時，它的矢量和將產(chǎn)生的一橢圓軌道長軸：矢量相位相同時的強度短軸：矢量相位相反時的強度：平面偏振光離開樣品槽的 角度橢圓度= M

6、/100lc=3300153、測量裝置16四、康頓效應(cotton effect)及ORD、CD和UV間的關(guān)系1、在紫外和可見區(qū)內(nèi)無發(fā)色團的飽和化合物，則ORD光譜呈現(xiàn)單調(diào)下降或上升的曲線，若手性化合物的紫外吸收在儀器測量范圍內(nèi)則出現(xiàn)S型曲線稱cotton效應17即形成一個峰和一個谷組成的ORD譜線簡單的Cotton效應正Cotton效應：波長由長波向短波移動時，ORD譜由峰向 谷變化負Cotton效應：波長由長波向短波移動時，ORD譜由谷向 峰變化k: ORD線與零線相交點振幅：谷至峰的距離摩爾振幅=(1 -2)/1001:ORD頂峰處的摩爾旋光度2:ORD谷底處的摩爾旋光度182、CD的

7、康頓效應正的康頓效應： 或為正值且有峰的CD曲線負的康頓效應： 或為負值且有谷的CD曲線3、ORD、CD和UV光譜間的關(guān)系（1）ORD和CD是同一現(xiàn)象的兩個方面，都是光與手性物質(zhì)作用而產(chǎn)生的。主要目的是研究手性化合物的構(gòu)型與構(gòu)象，在該方面兩者提供的信息總是等價的。UV反映了光與分子的能量交換。19(2)理想情況下：max（UV） =max(CD) =k (ORD)實際情況：三者接近，但不一定重合ORD譜和CD譜都可用來測定有特征吸收的手性化合物的絕對構(gòu)型CD譜：容易解析ORD譜：比較復雜20 不對稱分子某生色團吸收峰的Cotton effect 的正負號與該生色團的手性中心的構(gòu)型有關(guān)聯(lián)，故可分

8、析分子的絕對構(gòu)象。ORD摩爾振幅與CD譜中或的關(guān)系=0.0122=40.28211、在立體結(jié)構(gòu)化學研究中的應用 對于羰基化合物，特別是環(huán)酮類化合物的研究較多，并形成了半經(jīng)驗的“八區(qū)律”來推測其立體結(jié)構(gòu)：八個區(qū)域的劃分如下圖所示：五、應 用22將環(huán)己酮按圖放好：觀察者迎著O=C的方向即從Y軸的負方向看Y軸的正方向。三個互相垂直的A、B、C平面將環(huán)己酮分割為八個區(qū)：OC前面的4個區(qū)由于取代基很難進入，對cotton效應貢獻小，不考慮OC后面的4個區(qū)貢獻大，其對cotton效應正負號的貢獻如下圖所示：C1,C2,C6A面上C2,C6的e鍵幾乎在A面上C2，C6的a鍵分別在下右和下左O，C1，C4B面

9、上23八區(qū)律1、位于三個平面上的取代基，對cotton效應貢獻為02、位于正負區(qū)的取代基效應可以抵消3、取代基的貢獻大小與性質(zhì)有關(guān)4、取代基對cotton效應的貢獻大小隨著與生色團的距離增大 而變小242,2,5-三甲基環(huán)己酮為例： b是a的投影圖，可看到：C1，C2，C4，C6，C7均處于分割面上，對cotton效應貢獻為0 C3與C5抵消， C8與C9正， 所以該化合物應有正的cotton效應25例2、天然油脂得一產(chǎn)物為3羥基3十九烷基環(huán)己酮，有正的cotton效應，試指出它的構(gòu)型解：按八區(qū)律，S構(gòu)型應有正的cotton效應，R構(gòu)型應有負的 cotton效應,故該環(huán)己酮衍生物為S構(gòu)型262

10、、生物大分子構(gòu)型、構(gòu)象的研究（1）蛋白質(zhì)或多肽中主要得光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫橋鍵可產(chǎn)生CD光譜，因而可用于蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)和氨基酸微環(huán)境的檢測。（a）蛋白質(zhì)CD譜27遠紫外區(qū)： 178-250nm 反映肽鍵的CD 肽鍵是高度有規(guī)則排列的，排列方向決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況 二級結(jié)構(gòu)不同，其CD位置、吸收強度則不相同 (2) -螺旋： 192nm有一正譜帶222209有兩個負的特征峰 -折疊 216nm:負峰185-200nm:正譜帶28-轉(zhuǎn)角：206nm有一正譜帶左手螺旋的P2結(jié)構(gòu)：有負的譜帶近紫外區(qū):(1)250-320nm-處于不對稱微環(huán)境的芳香氨基酸殘基、

11、二硫鍵(2)可作為光譜探針研究它的不對稱微環(huán)境的擾動(b) 研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)通過遠紫外CD譜研究蛋白質(zhì)-螺旋、 -折疊 、-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的分量 29(C) 研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)： chymotrypsin (all b) lysozyme (a + b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a)30三級結(jié)構(gòu)模型可分為：全型-螺旋 40%-折疊 5%全型-螺旋 40%+ 型：-螺旋、 -折疊均大于15%，這兩種結(jié)構(gòu)在空間是分離的， 60%的折疊鏈是反平行的/型：-螺旋、 -折疊均大于15%，這兩種結(jié)構(gòu)在空間上是相間的， 60%的折疊鏈平行排列

12、31(d)研究氨基酸殘基的微環(huán)境：蛋白質(zhì)中芳香氨基酸殘基：色氨酸(Trp)酪氨酸(Tyr)苯丙氨酸(Phe)二硫鍵處于不對稱微環(huán)境時250-320nm出現(xiàn)CD信號Trp:279,284和291nmTyr:277nmPhe:255,261和268nm二硫鍵:整個近紫外CD譜32例：陽離子表面活性劑CPB誘導BSA構(gòu)象CD光譜的變化Figure 3 Far-UV CD (a) and near-UV CD (b) spectra of BSA and BSA in CPB1. BSA; 2. BSA in 1.010-5mol/L CPB; 3. BSA in 1.010-4 mol/L CPB3

13、3由遠紫外CD譜可以看出 -螺旋 -折疊 BSA 49% 9.8%CPB（第一CMC） 78% 7.6%CPB（第二CMC） 37% 10.5% 由近紫外CD譜可以看出 自然狀態(tài)下BSA分子的near-UV CD光譜圖中在261 和268 nm處有最小值，在277 和284 nm處有兩個肩峰。當加入CPB后，261和268 nm處的橢圓率增加，而280 至300 nm處的橢圓率降低，表明此時氨酸酸殘基周圍環(huán)境的極性發(fā)生了變化 ，這種變化是由于雙硫鍵橋的不對稱性遭到破壞而引起B(yǎng)SA分子三級結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。34(2) 核酸 278nm有一強正的cotton效應-對應于堿基的堆積 248nm有一弱的

14、負的cotton效應-對應于螺旋性(形)35Z-form: 290nm有一負的cotton效應A-form:280nm有正的cotton效應243nm有負的cotton效應正的強度約為負的強度的3倍(b) 典型的DNA構(gòu)型B-form:277nm有正的cotton效應245nm有負的cotton效應C-form:285nm有正的cotton效應(弱)250nm有負的cotton效應(強)363、誘導園二色譜(1)主客體化合物主體為手性客體為非手性，但有吸收會產(chǎn)生誘導園二色譜例如環(huán)糊精與客體相互作用包結(jié)-產(chǎn)生誘導園二色譜客體結(jié)合在環(huán)糊精外部-不產(chǎn)生誘導園二色譜若客體的電偶極矩與環(huán)糊精Z軸重合正cotton效應若客體的電偶極矩與環(huán)糊精Z軸垂直負cotton效應37六、實驗中幾個注意事項 用N2除臭氧和氧氣； 樣品的濃度應使其吸光度在0.61.2之間，可得到較好 的信躁比，對蛋白質(zhì)來說濃度在0.2mg/mL，池子長度 是1mm，池體積是350mL； 溶劑和緩沖溶液選擇的原則是使樣品在測定的波長范圍 內(nèi)其吸光度盡量的?。ㄈ軇┑奈毡砣缦拢?；不能用 HCl來調(diào)pH，因為在低的UV波段Cl-離子會干擾CD的 測定 狹縫帶寬（SBW）的選擇：SBW應保持至少為NBW （被掃描物質(zhì)的