正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選魚腥草胰蛋白酶抑制劑的提取工藝

1、正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選魚腥草胰蛋白酶抑制劑的提取工藝【摘要】目的研究魚腥草中胰蛋白酶抑制劑活性成分的最正確提取條件。方法以提取液對胰蛋白酶的抑制率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對提取溫度(A)、溶劑用量(B)、pH值()、提取時間(D)4個因素進(jìn)展優(yōu)選研究，并以優(yōu)選出的提取方案進(jìn)展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果因素B對提取效果有極顯著的影響，因素A、均有顯著的影響，因素D影響不顯著。結(jié)論魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最正確提取工藝為A1B23D2。【關(guān)鍵詞】魚腥草胰蛋白酶抑制劑正交實(shí)驗(yàn)Abstrat:bjetiveTptiizetheextratinpredurefrtrypsininhibitrfrHuttuyni

2、ardataThunb.ethdsTheinhibitinrateftrypsinativityasusedassreeningparaeter,eeplyedtherthgnaldesignethdttesttheeffetsffurfatrs,inludingteperaturefextratinslutin(A),vluefextratinslutin(B),pHvaluefextratinslutin()andtiefextratin(D),ntheextratinftrypsininhibitr.ResultsFatrBperfredthestsignifianteffetnthee

3、xtratin,andfatrsAandaethenextandfatrDthelast.nlusinTheptiuextratintehnlgyisA1B23D2hentheinhibitinratiftrypsinativityisnsideredaspreferentialparaeter.Keyrds:HuttuyniardataThunb.;Trypsininhibitr;rthgnaldesign蛋白酶抑制劑prtEinaseinhibitr,PI是一類可以抑制蛋白水解酶活性的物質(zhì)，廣泛存在于動植物和微生物中1。其中胰蛋白酶抑制劑Trypsininhibitr,TI具有重要的藥用價(jià)

4、值,對急性胰腺炎、肺氣腫、抗休克、防治腦水腫和腦缺血等都有很好的臨床治療效果，還有研究說明對HIV和腫瘤的治療也有重要意義2。因此，從傳統(tǒng)中藥中挑選具有TI活性的材料有很廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。魚腥草為三白草科植物蕺菜HuttuyniardataThunb.的地上局部，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之成效，是臨床應(yīng)用極其廣泛的中藥之一3。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期挑選的結(jié)果，利用魚腥草為材料對從魚腥草中提取TI的工藝進(jìn)展優(yōu)化，找出最正確的提取條件，為今后的工業(yè)化消費(fèi)TI提供根底性數(shù)據(jù)。1儀器與試劑1.1試劑胰蛋白酶(北京麒麟宏偉公司)、大豆蛋白酶抑制劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑、苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺BA

5、PNA上海三杰生物技術(shù)、三-羥甲基-氨基甲烷、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等為國產(chǎn)分析純；魚腥草。1.2儀器可見光分光光度計(jì)(7202B)、離心機(jī)LD-4、精細(xì)pH計(jì)、水浴鍋、精細(xì)電子天平FA2022N。2方法2.1魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)46及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用雙蒸水作為提取TI的溶劑。稱取枯燥的魚腥草全草5g，粉碎，在平行操作條件下，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)展提取實(shí)驗(yàn)，以胰蛋白酶活性大小為指標(biāo)，進(jìn)展9次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次正交因素程度見表1，然后過濾并搜集濾液，減壓濃縮到100l。表1因素程度略2.2魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分對胰蛋白酶的抑

6、制率測定方法采用苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺BAPNA法7：取胰蛋白酶液1l，加藥材提取液1l在37水浴保溫5in，參加BAPNA溶液5l，37水浴保溫10in后，立即加1l三氯乙酸30%終止反響，用分光光度法在410n條件下測定吸光度。按以下公式計(jì)算樣品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr)-(As-Abs)(Ar-Abr)100%式中：i抑制百分率；Ar標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度；Abr含標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白對照液的吸光度；As樣品溶液的吸光度；Abs含樣品溶液的空白對照液的吸光度。3結(jié)果與方差分析結(jié)果見表2，表3。由方差分析可知，各因素對提取效果的影響程度依次為BAD，其中因素B為高度顯著，因素A，影

7、響顯著，因素D沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對試驗(yàn)結(jié)果的影響很校由R值可知,各因素對試驗(yàn)結(jié)果的重要次序?yàn)锽AD?？紤]到規(guī)?；M(fèi)中經(jīng)濟(jì)、效率等因素,本文優(yōu)選工藝A1B23D2,即在60，用30倍量水,pH值為9，3h/次為最正確提取工藝。按照此工藝條件進(jìn)展3次平行實(shí)驗(yàn)，測定提取液對胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果平均抑制率為58.27%，說明本實(shí)驗(yàn)確定的工藝道路穩(wěn)定可靠。表2L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果略表3正交實(shí)驗(yàn)的方差分析略4討論因素A對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，60時提取活性最高，隨著溫度的上升抑制率有下降的趨勢，說明隨著溫度的上升對TI有失活的作用。因素B對實(shí)驗(yàn)有高度顯著的影響，在所有因素中影響最顯著，說明隨著溶劑量

8、的增加會進(jìn)步TI的提取效率，但從變化趨勢看當(dāng)30倍量時繼續(xù)增加溶劑量，TI的提取率增幅不是很明顯，因此考慮消費(fèi)本錢和效益用30倍量是最好的。因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有顯著影響，隨著pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，這說明在堿性條件下提取效率升高。本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)法對提取工藝條件進(jìn)展了優(yōu)化,并按最正確工藝進(jìn)展了驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果證明用該工藝作為魚腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工藝簡單、提取率高、操作控制容易、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1PandyaJ,SithDA,YardA,etal.pleteainaidsequenesftinhibitrsfrbukheatseedJ.Phytheistry,1997,43:327.2文方德，傅家瑞.植物種子的蛋白酶抑制劑及其生理功能J.植物生理學(xué)通訊，1997，331：1.3劉喜綱，劉翠哲.魚腥草的藥理作用研究進(jìn)展J.中華中西醫(yī)學(xué)雜志，2022，92：13.4屈紅麗，可鈺，尹鵬，等.冬凌草中總黃酮提取工藝研究與含量測定J.時珍國醫(yī)國藥，2022，1710：1929.5游見明.大孔樹脂別離魚腥草總黃酮的研究J.現(xiàn)代食品科技，2022，212：66.6劉永剛，陳玉娟，劉倩，等.中烏頭次堿制備工藝的研究J.時珍國醫(yī)國藥，2022，