分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

1、分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用第1頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一 狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)，是通過對DNA或RNA的檢測來實現(xiàn)對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成，以及由此而帶來的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。一、分子診斷的概念第2頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一根據(jù)分子診斷技術(shù)特征劃分為三類

2、：一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù) 兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補的分子雜交反應(yīng)。第3頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一二、基于測序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù) DNA的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達水平上的個性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測，最終都可以借助基因測序平臺的應(yīng)用。第4頁，共32頁，2022年

3、，5月20日，10點6分，星期一三、基于擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù) 1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），使體外擴增DNA成為可能，開啟了體外擴增和操作DNA或RNA技術(shù)的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴增DNA的技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴增檢測技術(shù)。第5頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一二、PCR概述（一）PCR概念 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等

4、步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項體外核酸擴增技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。第6頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一 PCR技術(shù)能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述第7頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年 熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR 發(fā)展簡史1983 Mullis于12月16日成功發(fā)明

5、了PCR1985 關(guān)于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等人 在Science雜志上發(fā)表1989 12月Science雜志將PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993 10月13日 Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎 1995 熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)第8頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一PCR技術(shù) PCR核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應(yīng)不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化，使應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項突破性技術(shù)。第9頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一P

6、CR概述2000至2013年發(fā)表論文1280748篇第10頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA 變性 退火 延伸 （膜板） （雙鏈分成單鏈） （膜板與引物雜交） （DNA合成）不斷重復(fù)PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系第11頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴增、忠實復(fù)制！PCR反應(yīng)的特點第12頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測

7、優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一 病原體檢測第13頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一常規(guī)結(jié)核病實驗室診斷方法及不足1. 痰涂片作抗酸染色：陽性率低 、費時2. 細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(4-8W)3. 血清學(xué)診斷： a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應(yīng)，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！第14頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一熒光定量PCR檢測

8、TB-DNA的意義1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結(jié)核 血液播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核病第15頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù) 熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義第16頁，共32頁

9、，2022年，5月20日，10點6分，星期一二 腫瘤相關(guān)基因表達的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第17頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一三 遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第18頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一四 其它應(yīng)用1. 法醫(yī)學(xué)鑒定2. 抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)3. 縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第19頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一窗口期：所謂“窗口期”,是

10、指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時間。美國90以上輸血傳播HIV和HBV以及75以上輸血HCV的危險性均來自“窗口期”感染獻血。第20頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義項目ELISA窗口期項目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10第21頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一RNA+ Ab-P24+ Ab -血清陽轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽轉(zhuǎn)抗體檢測臨界值 特異性抗體比例時間反應(yīng)指標(biāo)感染 血清陽轉(zhuǎn)前的方法怎樣

11、檢測HIV早期感染?第22頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一 嬰幼兒感染HIV診斷：12月內(nèi)核酸檢測，13-17月先抗體，陽性者檢測核酸，18個月以上抗體檢測第23頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一四、PCR檢測的標(biāo)本采集要求項目標(biāo)本采集所需容器CT男性： 尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約24厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜），前列腺液、精液。女性： 陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV第24頁，共32頁，2022年，5月

12、20日，10點6分，星期一項目標(biāo)本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。 2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰13ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個核細(xì)胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽取）MP 咽拭子第25頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一五、NAT（核酸檢測）技術(shù)類型：第26頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一實

13、時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（SAT）實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（SAT）是將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。國內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)。第27頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一（SAT）技術(shù)原理： 同一溫度下（42），以RNA為起始模板，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個（1001000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器

14、實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況。第28頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一SAT 檢測技術(shù)的優(yōu)勢：檢測靶標(biāo)：RNA 靈敏度高，特異性強，易鑒別死菌、活菌，適合臨床判愈;擴增產(chǎn)物：RNA 高效擴增，低污染;核酸提?。捍胖榉?提取純度高 結(jié)果準(zhǔn)確;檢測方法：實時熒光檢測，擴增、檢測同時進行全程監(jiān)控;擴增方式：42恒溫 無需熱循環(huán)，設(shè)備成本低。第29頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一總結(jié) 分子診斷技術(shù)經(jīng)歷近30年的快速發(fā)展，已經(jīng)形成了主要以雜交、測序和擴增三種反應(yīng)模式為主的測試技術(shù)群，并且在臨床診斷中獲得了廣泛的應(yīng)用。原位雜交為主的技術(shù)對于檢測基因表達異常的

15、遺傳性疾病具有明顯的優(yōu)勢，已成為細(xì)胞遺傳學(xué)實驗室最有力的檢測工具之一。而全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得高通量的測序方式來檢測全基因的表達差異或突變檢測的成本均大大降低，而且測試速度將逐漸適合臨床的需求，因此對于大量基因的表達和突變檢測，高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢將會越趨明顯。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技術(shù)對于感染性疾病、低突變位點或變異的檢測，在成本上明顯優(yōu)于前兩者，因此PCR技術(shù)可能在臨床上擁有更好的應(yīng)用空間。 不同的技術(shù)平臺有各自的優(yōu)缺點，我們要針對不同的實驗標(biāo)本對象及需求,選擇適合的技術(shù)方法，力求在“高效,高質(zhì)量,低成本”這三者間找到合適的平衡點。第30頁，共32頁，2022年，5月20日，10點6分