DB12-T841-2018轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分定量檢測技術(shù)規(guī)范微流滴數(shù)字PCR法

1、ICS 65. 020. 20B 04DB12天 津 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T 8412018轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分定量檢測技術(shù)規(guī)范微流滴數(shù)字PCR法Technical guidelines for quantitative detection of genetically modified plants andderived productsDroplet digital PCR method2018-12-01 實(shí)施2018- 11 -07 發(fā)布天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會 發(fā)布DB12/T 8412018 I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1. 12009給岀的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工

2、作委員會提岀并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、天津 市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、蘭璞、李亮、趙新、沈曉玲、王成、宛煜嵩、陳銳、黃鳳軍、李文、 李益歌。DB12/T 8412018 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分定量檢測技術(shù)規(guī)范微流滴數(shù)字PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品微流滴數(shù)字PCR檢測方法的建立與確認(rèn)的總體要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測的微流滴數(shù)字PCR檢測方法的建立與確認(rèn)。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2. 1微流滴數(shù)字PCR droplet digital PCR將DNA模板、引

3、物/熒光探針、耐熱DNA聚合酶及其緩沖液等PCR反應(yīng)體系充分混勻后，通過乳化的方 式分配至體積相同且相互物理隔離的油包水微流滴中。將形成的微流滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的微流 滴進(jìn)行熒光信號采集，通過陽性率和泊松分布計(jì)算獲得樣品中靶序列拷貝數(shù)或拷貝數(shù)濃度。2. 2靶序列 target sequence在PCR檢測方法中，用作檢測靶標(biāo)的特異性DNA序列。2. 3特異性 spec i f i c i ty實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針對樣品中靶標(biāo)片段精準(zhǔn)識別的能力。2. 4定量限 I imit of quant i f i cat i on (LOQ)在可接受的正確度和精密度水平上，樣品中被定量檢

4、岀的最低DNA模板含量或濃度。2. 5正確度 trueness多次測試的均值與采納的標(biāo)準(zhǔn)值之間的接近程度。2. 6方法確認(rèn) va I i dat i on of method通過提供明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證明所使用的檢測方法能夠充分滿足測試目標(biāo)的需求。3實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物數(shù)字PCR檢測方法制定的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)滿足以下要求：具備資質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物安全機(jī)構(gòu)，從事過轉(zhuǎn)基因植物成分定量測量工作，參加過權(quán)威部門組織 的轉(zhuǎn)基因植物定量測量能力驗(yàn)證或計(jì)量比對，并且測量結(jié)果在可控范圍內(nèi)；具備承擔(dān)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測工作所需的儀器設(shè)備和環(huán)境設(shè)施；轉(zhuǎn)基因植物數(shù)字PCR檢測方法研制人員應(yīng)具備轉(zhuǎn)基因生物安全檢測工作相關(guān)業(yè)務(wù)知

5、識。4技術(shù)要求4. 1 方法的建立4. 1. 1檢測引物和探針的設(shè)計(jì)與篩選依據(jù)靶序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行比較分析，篩選岀適合的引物和探針組合，確保其 對靶序列具有嚴(yán)格的特異性和符合要求的檢測靈敏度。4. 1.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化通過試驗(yàn)確定適合的反應(yīng)體系（模板量、引物、探針濃度等）及反應(yīng)程序（退火溫度、循環(huán)數(shù)等）， 能有效區(qū)分微反應(yīng)體系的陽性信號和陰性信號。采用多重PCR檢測方法的，應(yīng)提供與單重PCR檢測方法的 對比結(jié)果。4.1.3方法特異性測試通過試驗(yàn)驗(yàn)證檢測方法的特異性；特異性測試樣品至少應(yīng)包括三類：含有靶序列的轉(zhuǎn)基因植物材料；不含有靶序列的轉(zhuǎn)基因植物材料；不含靶序

6、列的非轉(zhuǎn)基因植物材料。4. 1.4方法靈敏度測試依據(jù)技術(shù)平臺，選擇合理的靶序列拷貝數(shù)濃度測試范圍，確定方法的線性動態(tài)范圍和定量限。靈敏 度測試濃度點(diǎn)數(shù)不少于5個(gè)，至少3次重復(fù)，每次試驗(yàn)至少設(shè)置3個(gè)平行。4. 1.5方法適用性測試選擇合適的加工品類型，測試方法的適用性。4.2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法驗(yàn)證4. 2. 1線性度微流滴數(shù)字PCR方法的線性度以線性回歸曲線的決定系數(shù)R2表示，均值應(yīng)N0. 984.2.2精密度線性動態(tài)范圍內(nèi)的精密度用重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr表示，應(yīng)W25%。4.2.3正確度在整個(gè)線性動態(tài)范圍內(nèi)，多次測試的均值與采納的標(biāo)準(zhǔn)值之間的接近程度，且偏差不超過標(biāo)準(zhǔn)值的 25%4. 2. 4定

7、量限線性動態(tài)范圍內(nèi)，符合精密度條件的最低拷貝數(shù)濃度。4. 2. 5再現(xiàn)性3DB12/T 8412018由兩個(gè)不同操作人員，在兩個(gè)不同時(shí)間段，對包含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同批樣品（至少包括陽性樣品、 陰性樣品和定量限樣品）進(jìn)行測試。測試結(jié)果與預(yù)期偏差RSD應(yīng)25%,表明方法再現(xiàn)性符合要求。否 則，重新進(jìn)行相關(guān)測試。4.3實(shí)驗(yàn)室間方法確認(rèn)4.3. 1經(jīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確認(rèn)符合要求后，組織多家實(shí)驗(yàn)室對檢測方法的特異性、靈敏度和再現(xiàn)性進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)室間確認(rèn)。4.3.2實(shí)驗(yàn)室間方法確認(rèn)樣品應(yīng)包括陽性對照樣品、陰性對照樣品、特異性測試樣品和靈敏度測試樣 品。4. 3. 3特異性測試樣品應(yīng)包括：含有靶序列的轉(zhuǎn)基因植物材料；不含有靶序列的轉(zhuǎn)基因植物材料；不含靶序列的非轉(zhuǎn)基因植物材料。4.3.4靈敏度測試樣品應(yīng)包括定量限樣品。4.3.5至少重復(fù)3次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)至少設(shè)置3個(gè)平行。4.3.6實(shí)驗(yàn)室間方法確認(rèn)不少于6個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供有效數(shù)據(jù)。且至少重復(fù)3次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)至少設(shè)置 3個(gè)平行。4.3.7線性度、精密度、正確度按照5. 2要求。4.3.8依據(jù)驗(yàn)證單位岀具的驗(yàn)證報(bào)告，從以下方面對建立的方法進(jìn)行綜合分析：特異性分析：陽性對照樣