DB12-T841-2018轉基因植物及其產品成分定量檢測技術規(guī)范微流滴數字PCR法

1、ICS 65. 020. 20B 04DB12天 津 市 地 方 標 準DB12/T 8412018轉基因植物及其產品成分定量檢測技術規(guī)范微流滴數字PCR法Technical guidelines for quantitative detection of genetically modified plants andderived productsDroplet digital PCR method2018-12-01 實施2018- 11 -07 發(fā)布天津市市場和質量監(jiān)督管理委員會 發(fā)布DB12/T 8412018 I本標準按照GB/T 1. 12009給岀的規(guī)則起草。本標準由天津市農村工

2、作委員會提岀并歸口。本標準起草單位：天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所、中國農業(yè)科學院生物技術研究所、天津 市東麗區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所。本標準主要起草人：蘭青闊、蘭璞、李亮、趙新、沈曉玲、王成、宛煜嵩、陳銳、黃鳳軍、李文、 李益歌。DB12/T 8412018 轉基因植物及其產品成分定量檢測技術規(guī)范微流滴數字PCR法1范圍本標準規(guī)定了轉基因植物及其產品微流滴數字PCR檢測方法的建立與確認的總體要求。本標準適用于轉基因植物及其產品成分檢測的微流滴數字PCR檢測方法的建立與確認。2術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2. 1微流滴數字PCR droplet digital PCR將DNA模板、引

3、物/熒光探針、耐熱DNA聚合酶及其緩沖液等PCR反應體系充分混勻后，通過乳化的方 式分配至體積相同且相互物理隔離的油包水微流滴中。將形成的微流滴進行PCR擴增，對擴增后的微流 滴進行熒光信號采集，通過陽性率和泊松分布計算獲得樣品中靶序列拷貝數或拷貝數濃度。2. 2靶序列 target sequence在PCR檢測方法中，用作檢測靶標的特異性DNA序列。2. 3特異性 spec i f i c i ty實時熒光定量PCR的引物和探針對樣品中靶標片段精準識別的能力。2. 4定量限 I imit of quant i f i cat i on (LOQ)在可接受的正確度和精密度水平上，樣品中被定量檢

4、岀的最低DNA模板含量或濃度。2. 5正確度 trueness多次測試的均值與采納的標準值之間的接近程度。2. 6方法確認 va I i dat i on of method通過提供明確的實驗證據，證明所使用的檢測方法能夠充分滿足測試目標的需求。3實驗室資質進行轉基因植物數字PCR檢測方法制定的實驗室，應滿足以下要求：具備資質的轉基因生物安全機構，從事過轉基因植物成分定量測量工作，參加過權威部門組織 的轉基因植物定量測量能力驗證或計量比對，并且測量結果在可控范圍內；具備承擔轉基因生物安全檢測工作所需的儀器設備和環(huán)境設施；轉基因植物數字PCR檢測方法研制人員應具備轉基因生物安全檢測工作相關業(yè)務知

5、識。4技術要求4. 1 方法的建立4. 1. 1檢測引物和探針的設計與篩選依據靶序列設計引物和探針，通過實驗對其進行比較分析，篩選岀適合的引物和探針組合，確保其 對靶序列具有嚴格的特異性和符合要求的檢測靈敏度。4. 1.2 PCR反應體系和反應程序優(yōu)化通過試驗確定適合的反應體系（模板量、引物、探針濃度等）及反應程序（退火溫度、循環(huán)數等）， 能有效區(qū)分微反應體系的陽性信號和陰性信號。采用多重PCR檢測方法的，應提供與單重PCR檢測方法的 對比結果。4.1.3方法特異性測試通過試驗驗證檢測方法的特異性；特異性測試樣品至少應包括三類：含有靶序列的轉基因植物材料；不含有靶序列的轉基因植物材料；不含靶序

6、列的非轉基因植物材料。4. 1.4方法靈敏度測試依據技術平臺，選擇合理的靶序列拷貝數濃度測試范圍，確定方法的線性動態(tài)范圍和定量限。靈敏 度測試濃度點數不少于5個，至少3次重復，每次試驗至少設置3個平行。4. 1.5方法適用性測試選擇合適的加工品類型，測試方法的適用性。4.2實驗室內方法驗證4. 2. 1線性度微流滴數字PCR方法的線性度以線性回歸曲線的決定系數R2表示，均值應N0. 984.2.2精密度線性動態(tài)范圍內的精密度用重復性相對標準偏差RSDr表示，應W25%。4.2.3正確度在整個線性動態(tài)范圍內，多次測試的均值與采納的標準值之間的接近程度，且偏差不超過標準值的 25%4. 2. 4定

7、量限線性動態(tài)范圍內，符合精密度條件的最低拷貝數濃度。4. 2. 5再現性3DB12/T 8412018由兩個不同操作人員，在兩個不同時間段，對包含不同質量分數的同批樣品（至少包括陽性樣品、 陰性樣品和定量限樣品）進行測試。測試結果與預期偏差RSD應25%,表明方法再現性符合要求。否 則，重新進行相關測試。4.3實驗室間方法確認4.3. 1經實驗室內方法確認符合要求后，組織多家實驗室對檢測方法的特異性、靈敏度和再現性進行 實驗室間確認。4.3.2實驗室間方法確認樣品應包括陽性對照樣品、陰性對照樣品、特異性測試樣品和靈敏度測試樣 品。4. 3. 3特異性測試樣品應包括：含有靶序列的轉基因植物材料；不含有靶序列的轉基因植物材料；不含靶序列的非轉基因植物材料。4.3.4靈敏度測試樣品應包括定量限樣品。4.3.5至少重復3次試驗，每次試驗至少設置3個平行。4.3.6實驗室間方法確認不少于6個實驗室提供有效數據。且至少重復3次試驗，每次試驗至少設置 3個平行。4.3.7線性度、精密度、正確度按照5. 2要求。4.3.8依據驗證單位岀具的驗證報告，從以下方面對建立的方法進行綜合分析：特異性分析：陽性對照樣