凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1、凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第1頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一主 要 內(nèi) 容凋亡概述凋亡檢測(cè)方法的歷史沿革DNA Ladder 實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果第2頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 Apoptosis Necrosis Apoptosis (Kerr and Wyllie, 1972)第3頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 Apoptosis A genetically programmed , non-necrotic cell death.Involved in tissue homeostasis, c

2、ell differentiation.Play major role in a variety of diseases(e.g. Alzheimer , AIDS , heart failure and cancer).第4頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 凋亡與壞死的差別第5頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 凋亡 壞死胞體 變小 變大胞膜 皺縮, 形成空泡 腫脹, 通透性改變結(jié)局 形成凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬細(xì)胞 崩解, 引起炎癥反應(yīng)胞核 涉及多個(gè)細(xì)胞, 組織結(jié) 構(gòu)被破壞濃縮, DNA斷裂成180200bp或其倍數(shù)的片段與其他細(xì)胞關(guān)系 不規(guī)則碎

3、裂, 溶解通常只影響散在單個(gè)細(xì)胞, 組織結(jié)構(gòu)不被破壞第6頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Apoptotic AssayMorphology DNA Fragmentation DNA LadderCaspase Activity Anti-PARP western blotCell Membrane Alteration Phosphotidylserine Exposure第7頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第8頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第9頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第10頁，共24頁

4、，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第11頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Apoptotic AssayMorphologyDNA Fragmentation DNA Ladder Caspase Activity Anti-PARP Western blotCell Membrane Alteration Phosphotidylserine Exposure第12頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一endonucleaseGel electrophoresis700520360180Base pairsDistance between c

5、uts = mutiple of 180 bps180 bps第13頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Apoptotic DNA LadderLane 1: MarkerLane 2: negative controlLane 3: DNA of apoptotic cellsLane 4: DNA of necrosis cells金標(biāo)準(zhǔn)第14頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞凋亡過程中,可發(fā)生特異性級(jí)聯(lián)生化反應(yīng),其中最具特色的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活. 此酶可作用于連接DNA的核小體間區(qū)域, DNA鏈被切割成180200bp或其整倍

6、數(shù)的片斷. 抽提DNA, 經(jīng)瓊脂糖電泳可見梯狀電泳圖譜 第15頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 固定： 將細(xì)胞生前結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)雙重地保存下來，需要先固定。方法：1）物理固定，空氣干燥， 凍結(jié)干燥。2）化學(xué)固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。 第16頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一實(shí)驗(yàn)步驟 獲取凋亡細(xì)胞 抽提DNA 瓊脂糖凝膠電泳第17頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一實(shí)驗(yàn)步驟 取16g大小的小白鼠, 外科手術(shù)取胸腺 少許洗去血跡 放入研磨器中(160目)研磨, 邊磨邊加1640液, 獲取單個(gè)胸腺細(xì)胞.將所得混懸液倒入三角燒杯

7、, 加入120ml 1640液(一般一只小白鼠可獲2x106/ml 細(xì)胞) 第18頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一每孔加入1.2ml DEX(5mg/ml)混勻, co2培養(yǎng)箱, 370c, 5h 取1ml混懸液, 加入24孔培養(yǎng)板中 將每孔細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的Ep管中, 3000rpm, 5min, 去上清, 加入70%乙醇700ml混勻.震蕩打散細(xì)胞,-200c固定過夜 第19頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 離心， 3000rpm， 5min, 去上清（不要回倒， 棉棒沾干液體，勿觸及沉淀） 將上清轉(zhuǎn)入1.5ml EP管，離心12000rpm

8、 3min加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k, 混勻， 600c水浴，30-45min 100ul飽和Nacl, 充分震蕩，離心12000rpm 3min第20頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一將上清轉(zhuǎn)入無水乙醇管，顛倒離心管數(shù)次可見白色絮狀物（DNA）離心12,000 rpm，1min，棄上清，并用棉簽吸干殘留的無水乙醇 析出的DNA應(yīng)成小白點(diǎn)狀沉淀于管底，如貼附于管壁，加溶解液時(shí)應(yīng)小心。第21頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一取凝膠到凝膠成像儀上拍照分析加入20ul溶解液至管中，反復(fù)吸打數(shù)次至DNA溶解 電泳80v,1h 吸出20ul已溶解的凋亡細(xì)胞DNA，加入到2%瓊脂糖凝膠孔電泳第22頁，共24頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一1. 取出胸腺后, 一定要注意將組織去除干凈。2. 樣本須先經(jīng)70%乙醇固定,以防止DNA降解。3. 70%乙醇, 無水乙醇應(yīng)-200c預(yù)冷。4氯仿抽提蛋白時(shí)，應(yīng)用振蕩器劇烈振蕩，吸移上清時(shí)，注