分光光度計講稿

1、關于分光光度計第一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光學分析法 光學分析法是一類極其重要和最常用的儀器分析方法。它是基于電磁輻射與物質相互作用后產生的物理現(xiàn)象(輻射，吸收或散射)而建立起來的分析方法。它既可以進行定性，也可以進行定量和結構分析，其應用范圍非常廣泛。第二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光學分析法光譜法非光譜法 非光譜法是基于光與物質相互作用時，通過測量電磁輻射的 諸如折射、干涉、散射、衍射及偏振等基本性質發(fā)生變化的分析方法。 非光譜法中，電磁輻射只改變了傳播方向及速度等，而物質的內能不發(fā)生變化。屬于這類分析方法有的折射法、濁度法、旋光法、散射等方法。 光譜法

2、是基于光和物質相互作用時，測量由物質內部發(fā)生量子化的能級間的躍遷所產生的發(fā)射，吸收或散射光譜的波長和強度進行分析的方法。1. 光學分析法分類第三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 原子光譜是原子外層或內層電子產生能級躍遷而形成的，其光譜為線狀光譜。屬于原子光譜分析的方法有原子發(fā)射光譜法(AES)、原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS) 及X射線熒光光譜法(XFS, X-Ray Fluorescence Spectrometry )等。 光譜法原子光譜分子光譜 分子光譜則是分子中電子能級、振動和轉動能級的變化形成的，其光譜為帶狀光譜，也即連續(xù)光譜。屬于該類分析方法的有紫外-

3、可見分光光度法(UV-vis)，紅外吸收光譜法(IR)，分子熒光光譜法(MFS)及化學發(fā)光法(CLS)和分子磷光光譜法(MPS)等。2. 光譜法分類第四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月應用領域：物理學、化學、生物學、醫(yī)學、材料學、環(huán)境科學、化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金。分光光度法是建立在分子對于光吸收基礎上的一種分析方法，它屬于分子光譜的范疇?？捎糜跓o機物和有機物的定量分析，也可以進行有機物的定性及結構分析。3. 分光光度法第五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 物質顏色和吸收光顏色的關系 吸 收 光 物質顏色 顏 色 波 長(nm) 黃 綠 紫 400 450 黃 藍 4

4、50 480 橙 綠 藍 480 490 紅 藍 綠 490 500 紫 紅 綠 500 560 紫 黃 綠 560 580 藍 黃 580 600 綠 藍 綠 600 650 藍 綠 紅 650 750第六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月UV/VIS/NIR 光照射到物質上 入射光I0透射光I1 光程長 自光源 透射率 T =I0I1檢測器吸收光譜第七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月朗伯定律（1760年）：物質對光的吸收與物質厚度成正比:A=f(b)比耳定律（1852年）：物質對光的吸收與物質濃度成正比:A=f(c) 紫外/可見分光光度計的簡單原理：第八張，PPT共一

5、百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月LAMBERT-BEER定律此處T: 透射率e: 摩爾消光系數(shù)l: 光程長 C: 濃度 吸收 A = log = e C l1T 當一束平行的單色光通過某一均勻溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的長度的乘積成正比。成立條件：單色光 稀溶液第九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月A = log = - log T = e C l = abc吸光度、透過率與濃度的關系（波長、吸收池光程一定）%T 濃度1T第十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月分子吸收光譜 * 分子也具有特征的分子能級。分子內部的運動可分為: 價電子運動，分子中原子在平衡位置的振動

6、和分子繞其中心的轉動。因此分子具有電子能級、振動能級和轉動能級。 *當分子受到外界的光能照射之后，引起分子能級與原子能級躍遷不同。當分子受到外界的光能照射之后，引起了分子中價電子的能級躍遷, 同時，也引起分子中原子的振動能級和轉動能級的躍遷即從基態(tài)能級能級躍遷到激發(fā)態(tài)能級。第十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月電子能級差E最大，一般為120eV，電子光譜在紫外-可見區(qū)；吸收光波長范圍200 400 nm（近紫外區(qū)） ，可用于結構鑒定和定量分析。吸收光波長范圍400750 nm (可見區(qū))，主要用于有色物質的定量分析振動能級差E次之，一般為0.051eV；純振動光譜在紅外區(qū)；吸收光波

7、長范圍2.51000 m ,主要用于有機化合物結構鑒定。轉動能級差最小，一般為0.0510-4eV，純轉動光譜在遠紅外區(qū)。產生原因：吸收光譜產生是由于分子中價電子能級的躍遷和分子與離子中的振動及轉動能級的躍遷引起的。光譜與電子的躍遷第十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月*分子吸收能量同樣具有量子化的特征，即分子只能吸收等于兩個能量之差的光子能量，產生三種能級躍遷。由于三種能級躍遷所需能量不同，所以需要不同波長的電磁輻射使他們躍遷，及在不同的光學區(qū)域產生吸收譜帶，便產生了相應的三種光譜一電子光譜，振動光譜和轉動光譜。 E電子E振動E轉動 根據(jù)量子理論，分子吸收的能量應與能級差相對應，

8、也即被吸收的光子的頻率應與分子躍遷的能級差相適應： E=E2E1=h或=(E2-E1)/h=E/h 式中E電子、E振動、E轉動分別表示電子運動狀態(tài)的能量、分子中原子間的相對振動及分子繞其質量中心轉動的能量。第十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月*分子對紫外-可見光的吸收所產生的光譜是具有較寬波長范圍的吸收帶。在分子中每個電子在能級之間產生躍遷的同時伴隨有許多振動和轉動能吸的躍遷。所以，分子對紫外-可見光的吸所產生的光譜是具有較寬波長范圍的吸收帶，它是由許多波長非常接近的線狀光譜聚集而成，稱其為帶狀光譜。如圖所示。K2CrO4吸收曲線/nmA200 250 300 350 400 4

9、50 5000.600.10.20.30.40.5能量E230 240 250 260 270 nm苯蒸氣的吸收光譜第十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月可見分子的能量由多方面因素決定的，其總能量由下式表示： E總= E電子+E振動+E轉動 在分子中，每一個電子能級都有多個可能的振動能級存在；而每一個振動能級又有許多可能的轉動能級存在。所以，一個分子所具有的能級數(shù)目遠遠多于原子能級數(shù)目。因此，分子吸收光譜比原子光譜復雜得多。 紫外吸收光譜及可見吸收光譜，一般包含若干譜帶系，不同譜帶系相當于不同的電子能級躍遷，一個譜帶系（即同一電子能級躍遷）含有若干譜帶，不同譜帶相當于不同的振動能級

10、躍遷，同一譜帶內又包含若干光譜線，每一條相當于轉動能級的躍遷。它們的間隔約為0.25nm。一般的分光光度計，由于分辨率的限制觀察到的為合并成較寬的帶，所以分子光譜是一種帶狀光譜。第十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月AB純電子躍遷V，=02341純振動躍遷純轉動躍遷V=01圖9-3 雙原子分子的能級躍遷示意圖第十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月溶劑效應 一般紫外光譜的測定都是在稀溶液中進行。用特殊附件（積分球）可做固體樣品。 溶劑應能溶解測定的化合物，并在測定的波長區(qū)透明。 根據(jù)測定的波長范圍選溶劑，溶劑的透明范圍的下限應小于測定波長范圍。第十七張，PPT共一百零一頁

11、，創(chuàng)作于2022年6月苯在非極性溶劑庚烷溶液中，有一系列中等強度的吸收峰并有精細結構；但在極性溶劑乙醇中，其精細結構完全吸收，呈現(xiàn)一寬峰。因此，在繪制紫外一可見吸收光譜時須注明所用何種溶劑。 230 240 250 260 270 Amax圖9-7 苯在極性和非極性溶劑中的吸收光譜有些溶劑，尤其是極性溶劑的加入對溶質吸收光譜產生影響，引起吸收帶形狀、max及強度發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為溶劑效應.。 在紫外吸收光譜分析中常用水、乙醇、已烷、庚烷、環(huán)已烷、異辛烷等做溶劑。第十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 表2-3 紫外光譜用溶劑 溶 劑 透 明 下限（nm） 溶 劑 透 明下限 (

12、nm) 95% 乙 醇 210 乙 醚 210 水 210 異 辛 烷 210 正 己 烷 210 環(huán) 己 烷 210 二 氯甲烷 235 二 氧 六 環(huán) 230 四 氫 呋 喃 220 氯 仿 245 四 氯 化 碳 265 苯 280 DMF 270 丙 酮 330 異 丙 醇 210 甲 醇 215 乙 腈 210 庚 烷 210第十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月分光計的應用 紫外-可見分光光度法不僅可以用來進行物質的定量測定，定性分析及結構分析，還可以測量一些諸如摩爾比、分子量、穩(wěn)定常數(shù)、離解常數(shù)等物理化學參數(shù)。第二十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月nmR%

13、反射譜光學常數(shù)通常不能直接測量，但反射譜或吸收譜可以通過光度計來測量，根據(jù)K-K關系可從測得的譜圖計算求得任一光學常數(shù)1. 吸收反射透射光譜第二十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月Krames-Kronig 變換反射系數(shù)：r=rr +iri = r0eiqR(w)=f(w)R(w)=| r0 |2計算出所有的光學常數(shù)第二十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 定量分析 廣泛用于各種物料中微量、超微量和常量的無機和有機物質的測定。組分測定 對于簡單樣品單組分測定一般采用簡單的經(jīng)典方式。 標準對照法 標準曲線法 吸收系數(shù)比較法 標準加入法（可克服復雜樣品的基體效應 分為單

14、加入和多加入兩種) 最小二乘法（可消除用單一濃度標準溶液測定吸 收系數(shù)時實驗條件影響所引起的偶 然誤差。 差示分光光度法（可提高測定的高濃度或低濃 度的準確度)第二十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、標準曲線法 該方法是實際工作中常使用的方法。 具體做法是：配制一系列濃度不同的標準溶液，以空白試劑為參比，在相同測量條件下測定其吸光度，以吸光度A對濃度C作圖并繪制工作曲線。在相同條件下測量未知試樣的吸光度AX，在工作曲線上查找AX所對應的濃度即為未知液的濃度。根據(jù)測定的標準系列的數(shù)值建立線性回歸方程，并求出相關系數(shù)P(或R2)。若P在0.999X以上時，認為所建立的方法是符合比爾

15、定律的。第二十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月2、標準加入法(1)單標準加入法 在兩份相同量或體積的未知試樣的一份中加入一標準溶液，在相同條件下測量其吸光度AX和AX+S，根據(jù)下式計算未知液濃度CX 。 AXKCxAX+SK(CX+CS)(2)多次加入法 在57份相同量或體積的未知試樣溶液中加入46份濃度不同的標準溶液，組成一個新的標準系列，在相同測量條件下測定其吸光度值，以吸光度對Cs作圖，繪制工作曲線。該工作曲線是一條不過原點的曲線，與濃度軸的交點即為CX。 *用標準加入法，既可消除復雜基體對測定結果準確度的影響，又可用回收率的高低，來驗證某一分析方法的可靠性。第二十五張，P

16、PT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月3、差示分光光度法 在分光光度測定方法中，樣品的濃度過大過小，其吸光度值在0.20.8范圍之外，都會給測量結果帶來較大的誤差。為了克服上述不足，在實際工作中改用與試樣濃度差別不大的標準溶液代替空白溶液作參比，調節(jié)儀器的100%透光率或0%透光率，測量待測物質的方法即為差示分光光度法。它分為三類：(1)高濃度差示法 這種方法是用一個比待測組分濃度稍低一點的標準溶液(CS)為參比，調節(jié)儀器透光率為100%，然后測量未知樣品溶液的吸光度。假定用普通法測量用作參比的標準溶液的透光率為10%，試液的透光度為7%，二者讀數(shù)差僅為3%。當用差示法測量時，將參比液的透光率

17、讀數(shù)調到100%，此時，試液的透光率將會增加到70%，二者相差30%，相當于讀數(shù)標尺放大了10倍。第二十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T%試樣溶液 參比溶液 圖9-21 高濃度差示法標尺擴展示意圖第二十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月在差示法所測得的吸光度為ArAx-As，而 Aslcs Axlcx Arl(cxcs)lC (9-13) 上式中Cs為一固定值，所以Ar與Cx或C或線性關系，工作曲線為一過原點(原點不為0，為Cs)的直線

18、，且處在正常的讀數(shù)范圍之內(見圖9-21)。以Ar-Cx(或C)作圖，在工作曲線上根據(jù)Ar就可查出相應的Cx(或C)，CxCs+C。根據(jù)吸收定律推導出其相對誤差為 ,式中CXCS+C，CS是一個確定的較大值，C或CX很小，所以，測定結果非常準確，誤差很小。第二十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 低濃度差示法 這種方法是用一個較待測組分濃度稍高一點的標準溶液(CS)作參比，調節(jié)儀器透光率為0%，而用空白溶液調節(jié)透光率為100%，測定待測試液(CX)的透光率或吸光度的方法即為低濃度差示法。其原理示意圖見 圖9-22。0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10

19、0 Tx-Td0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T%試樣溶液TdTx參比溶液 圖9-22 低濃度差示法第二十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月例如 某一標準溶液(Cd)透光率Td為90%，待測液透光率TX為95%，二者透光率差5%。用前者代替光閘，調節(jié)儀器暗電流補償?shù)酵腹饴蔜為0%，用空白溶液作參比調T為100%，這時待測試樣溶液透光率(Tr)擴大到50%，二者透光率相差50%，也相當于讀數(shù)標尺擴大了10倍。由圖9-17推導出：（9-14)而待測組分的吸光度： AxlogTxlcg(Tr-TdTr+Td) -lcg(10-Ar-Td10-Ar+Td)l

20、cx (9-15) 可以看出，低濃度差示法的差示吸光度Ar與試樣濃度(Cx)不成線性關系，工作曲線為一過原點的曲線。第三十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)最佳精密度法 此法是上述兩種方法的結合，是用兩個標準溶液作參比，用一個較待測試液稍濃的參比液(Cd)調節(jié)儀器透光率為0%，再用一個較待測試液稍稀的參比液(Cs)調節(jié)透光率為100%，然后測定未知液(Cx)的吸光度。其原理如下頁圖。第三十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月圖9-23 最佳精密度差示法工作原理示意圖0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60

21、 70 80 90 100 T%參比溶液 試樣溶液參比溶液 Tx-TdTrTdTsTxTs -Td第三十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月由圖(9-18)式可推導出差示法的透光率Tr如下：則(9-17) 由(9-17)式可知最佳精密度差示法的差示吸光度Ar與Cx不呈線性關系，工作曲線為彎曲的線。第三十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)、多組分混合物的測定 如果混合物中含有兩種或兩種以上吸光物質時，吸收峰相互干擾各異。 簡單的情況是雙組分在各自最大吸收波長處相互不重迭，此時，可在各自最大吸收波長處測定吸光度。 在實際測定工作中，共存組分往往會干擾待測成分的測定。干擾

22、情況如圖9-24所示。第三十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 840 880 920 960 波長，nm 0.6 0.10.20.30.40.5ANdCl3DyCl3866nm915nm(1)NdCl3和DyCl3的吸收曲線；圖9-19 （1）第三十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 定性分析每一種化合物都有自己的特征光譜。測出未知物的吸收光譜，原則上可以對該未知物作出定性鑒定，但對復雜化合物的定性分析有一定的困難。 定性分析主要是用于有機物定性鑒別和結構分析。 利用紫外吸收光譜鑒定有機化合物主要依據(jù)是化合物的吸收光譜特征: 吸收曲線的形狀 吸收峰數(shù)目 吸收峰波長

23、 摩爾吸光系數(shù)第三十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 *紫外光譜對于差別有機化合物中發(fā)色基團和助色基團的種類、位置及其數(shù)目以及區(qū)別飽和與不飽和化合物、測定分子中共軛程度等有其獨特的優(yōu)點 *有機化合物的紫外吸收光譜只有少數(shù)幾個寬的吸收帶，缺乏精細結構。它只能反映分子中發(fā)色基團和助色基團及其附近的結構特性，而不能反映整個分子的特性。因此僅依靠紫外光譜來推斷未知化合物的結構是困難的。 *紫外光譜可用來測定共軛分子及芳族化合物分子的骨架，并可研究與共軛作用、溶劑穩(wěn)定化作用有關的分子構型以及互變異構現(xiàn)象和氫鍵等。 第三十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 用紫外光譜進行定性

24、鑒定的化合物必須是純凈的，并按正確操作方法用紫外分光光度計繪制出吸收曲線，然后根據(jù)該化合物的吸收特征作出初步判斷。 如果化合物紫外光譜在220400nm范圍內沒有吸收帶，則可以判斷該化合物可能是飽和的直鏈烴、脂環(huán)烴或其它飽和的脂肪族化合物或只含一個雙鍵的烯烴等。 若化合物只在270350nm有弱的吸收帶，則該化合物必含有n電子的簡單非共軛發(fā)色基團，如羰基、硝基等。第三十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 若化合物在210250nm范圍有強吸收帶，104Lmol-1cm-1,這是K吸收帶的特征，則該化合物可能是含有共軛雙鍵的化合物。如果強吸收帶出現(xiàn)在260300nm范圍內，則表明該化

25、合物存在3個或3個以上共軛雙鍵。如吸收帶進入可見光區(qū)，則該化合物是長共軛發(fā)色基團的化合物或是稠環(huán)化合物。 若化合物在250300nm范圍內有中等強度吸收帶，103 104Lmol-1cm-1 ，這是苯環(huán)B吸收帶的特征，因此該化合物很可能含有苯環(huán)。第三十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 按上述規(guī)律可以初步確定該化合物的歸屬范圍后，再將該化合物光譜與標準化合物的譜圖進行對照。 如果兩者吸收光譜的特征完全相同，則可考慮兩者可能是同一化合物，或者它們具有相同的分子骨架和發(fā)色基團。也可以與一已知的模型化合物的紫外光譜相對比后作出判斷。第四十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月1

26、、吸收曲線比較法 將未知物和所推測化合物的標準品在相同的酸度條件下，以相同的濃度配制在相同溶劑中，分別掃描吸收光譜。比較二者的吸收曲線，若二者一致，則可確定二者為同一化合物。如果沒有標準品時，也可和標準品的標準圖譜進行比較。 在實際測定中，也常用紫外吸收峰的最大吸收波長max和強度(即max)進行定性鑒定。通常用于定性分析的方法有以下幾種：第四十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月圖9-24 合成與天然VB2的紫外吸收光譜實線為合成VB2，虛線為天然VB2Log 342 300 350 400/nm第四十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月例如，煙堿(居古丁)在0.2mol

27、L-1H2SO4中max260nm，百分吸光系數(shù) 343。若某一化合物在相同條件下測定其max和 與純煙堿的數(shù)據(jù)相同，則該化合物結構與煙堿的結構基本相同。常用的標準圖譜有下列幾種：1、Sadtler Standard Spectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978 該標準圖譜總計收集了46000種化合物的紫外吸收光譜。2、Friedel R.A.and Orchin M.,：“Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds”,Wiley,New York,1951.3、Keyzo Hirayama:“Handbook of U

28、ltraviolet and Visible Absorption Spectra of Organic compounds”,New York,Plenum,19674、“Organic Electronic Spectral Data”,1946- 這是一套由眾多學者集多年之經(jīng)驗而共同編寫的大部頭手冊 性叢書，始于1946年，延續(xù)至今不斷續(xù)編。第四十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有時僅用紫外吸收光譜來確定一個未知化合的結構難以下結論時，還需要采用經(jīng)驗規(guī)則計算一些不飽和有機化合物的最大吸收波長max，并與實驗測得值加以比較，再確切認證化合物的結構。一般常采用的經(jīng)驗規(guī)則：1)

29、伍德沃德(Woodward)經(jīng)驗規(guī)則 這是計算共軛二烯、多烯烴和共軛烯酮類*躍遷最大吸收波長max的經(jīng)驗規(guī)則，如下表所示。計算過程中，先以母體生色團得到一個最大的吸收的基數(shù)，然后再加上連接在母體電子體系上的不同取代基(助生團）以及其它結構因素的修正值，即為計算值。2、經(jīng)驗規(guī)則計算法第四十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 純度的檢查如果某一化合物的紫外-可見光譜區(qū)無明顯的吸收峰，而它的雜質有較強的吸收峰，可利用這些非正常吸收峰檢查雜質的存在。 例如酒精在2001000nm范圍內無吸收峰，若在256nm處有一吸收峰且有振動帶，則證明酒精中可能含有雜質苯。 又如檢查CCl4中有無C

30、S2雜質，只要在318nm附近觀察有沒有明顯的吸收即可確定之。第四十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月另外，若某一有機化合物在可見區(qū)或近紫外區(qū)有較強的吸收峰，也可以利用吸收系數(shù)的大小來檢查其純度。例如: 菲的氯仿溶液在296nm處有一強吸收(log4.10)。用某一既定方法精制菲，測得其熔點為100，沸點為340，似乎很純凈，但用分光光度法檢查時，測得的log值為3.77，低于純菲log(4.10)，實際含量只有92%(即(3.77/4.10)100)，其余可能是蒽等雜質。第四十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 可疑化合物的證實6. 結構分析（如鑒定官能團）第四十

31、七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月按通過試樣及參比溶液的光束多少可分為： 單光束分光光度計 雙光束分光光度計按所提供的波長數(shù)分為： 單波長分光光度計 雙波長分光光度計分光光度計第四十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月原理示意圖時間式第五十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光源 單色器 樣品 檢測器 讀數(shù)裝置分光光度計的組成光電倍增管光電池 分光光度計結構示意圖光源提供的連續(xù)輻射，經(jīng)單色器色散后獲得有限波長范圍的輻射，待測物質吸收后到達檢測器，將光信號轉換成電信號(電壓或電流，在讀數(shù)裝置上顯示出測量值)。先進的

32、儀器配有記錄儀或微處理機進行控制和測量第五十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光源 在光度分析中所用的光源在所需的光譜范圍內能連續(xù)輻射出足夠穩(wěn)定和強度的輻射線，其輻射強度隨波長的變化波動不大，而且使用壽命要長。 分光光度分析中所用光源有: 熱光源(鎢燈、鹵鎢燈)、 氣體放電燈(氫弧燈、氘燈、氙燈、汞燈)、 激光光源 鎢燈適用波長范圍為 氫弧燈適用波長范圍為 3202500nm。 165350nm。第五十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月單色器 將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任 波長單色光的光學系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進入單色器； 準光裝置：透鏡或返射

33、鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；出射狹縫。單色器質量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質量。色散元件常用棱鏡和光柵。第五十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 樣品室 樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。檢測器 利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。玻璃吸收池-能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英吸收池-不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū) 一般石英比色器光

34、程為1cm，玻璃比色器光程有1cm、2cm、3cm等。第五十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月雙單色器的高靈敏度紫外可見分光光度計 UV-3150型（Shimadzu）配備高效率的雙單色器，高能量的裝置適合從液體樣品到硅、薄膜、玻璃、光學材料等的透射、反射測定。測定波長范圍： 1903200nm譜帶寬度： 0.130nm分辨率： 最小0.1nm雜散光： 0.00008%以下（220nm,Nal）分光器： 由2組3枚光柵構成的上單色器第五十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月UV-3150紫外可見近紅外分光光度計 第五十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月5 度入

35、射角反射附件鏡反射：入射角等于出射角，法線為對稱軸物體表面平整光滑第五十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月儀器光源：由氘燈和溴鎢燈組成，換燈波長可在340-360nm之間選擇檢測器：光電倍增光 和 PbS 光電池（近紅外區(qū)）樣品池： 石英比色皿 第五十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月石英比色皿的正確清潔方法附著有色物質時用1mol/L HCl-乙醇溶液(1:2)清洗，再用蒸餾水洗凈。附著油污時用5NaOH溶液清洗，再用蒸餾水洗凈。日常使用時直接使用清水洗凈，然后用純水再洗一次，置通風機吹干或者自然晾干即可。若太臟可用洗液清洗，但時間要短（幾秒鐘)，并立即用大量清水清洗

36、干凈。但不要用洗潔精之類的清潔劑，以免影響測量。注意事項一般石英比色皿為粘接的，盡量不要使用超聲波清洗，使用時間不要超過5分鐘，功率不要太大，要用清洗玻璃器皿的超聲波清洗機且清洗時毛面需朝下。使用超聲清洗很可能導致比色皿出現(xiàn)裂縫。 第五十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月積分球積分球，又稱光通球，是一個中空的完整球殼。內壁涂白色漫反射層，且球內壁各點漫射均勻。光源在球壁上任意一點上產生的光照度是由多次反射光產生的光照度疊加而成的。主要功能是光收集器，能收集樣品上的全部反射光，被收集的光可以用作漫反射光源或被測源。Intergrating Sphere inner Diameter

37、150mm fMearuring Wavelength Range 240-2400nm(UV-VIs-NIR)第六十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月原理 一束光聚射到積分球內壁時，經(jīng)過多次反射，內壁各點的照度相同。 Em=積分球壁按一定的規(guī)律開一樣品孔，依次放兩個樣品（其中一個做標準樣，已知其反射率），用同樣強度的一束光照射到樣品上，經(jīng)過多次反射，球壁各點的照度相同，任一點的照度與樣品的反射率成正比，在某一點放放置一個光能感受元件，其輸出與球壁上的照度成正比，兩次輸出值之比就等于兩個樣品的反射率之比。第六十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月積分球原理第六十二張，PPT

38、共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月0度與8度的區(qū)別測試范圍：紫外-可見 紫外-可見-近紅外第六十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月影響紫外儀器質量的幾個重要指標一、光度準確度與重復性定義：多次測量平均值與真值之差為光度準確度（T 、 A）；最大值與最小值之差為光度重復性。偏差越小，準確度越高。光度準確度和光度重復性是非常重要的技術指標，直接關系到測試結果的準確性。 光度準確度在不同的吸光度范圍是不同的，因此光度準確度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情況下測試的。影響光度準確度的主要因素有： 儀器的雜散光大小。 儀器的光譜帶寬 儀器的光度噪聲 試樣的制備 儀器的基線平直度

39、比色皿的性能 第六十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光度準確度的檢查: 一般用標準濾色片或的重鉻酸鉀的0.005mol/L H2SO4溶液。酸性重鉻酸鉀溶液的標準吸收值如下： 吸 光 度 測量波長(nm) 溶液A (50mg/L K2Cr2O7) 溶液B (100mg/L K2Cr2O7) 235（谷） 0.626 0.09 1.251 0.019 257（峰） 0.727 0.007 1.454 0.015 313（谷） 0.244 0.004 0.488 0.007 350（峰） 0.536 0.005 1.071 0.011第六十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6

40、月光度準確度與吸光度相對誤差和吸光度真值的關系第六十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、雜散光定義：單色器額定通帶以外的透射輻射能量與總的透射能量之比，也就是光譜通帶以外“不要的”光通量就是雜散光。 雜散光是一個非常重要的關鍵技術指標，它是紫外/可見分光光度計分析誤差的主要來源，直接限制被分析測試樣品的上限。當儀器的雜散光一定時，被分析樣品的濃度越大，其分析誤差就越大。 雜散光的主要來源： 1、灰塵沾污光學元件。 2、光學元件被損傷。 3、準直系統(tǒng)內部或有關隔板邊緣的反射。 4、光學系統(tǒng)屏蔽不好。 5、熱輻射或熒光引起的二次電子反射。 6、狹逢的缺陷。 7、光學系統(tǒng)的像差。、 8

41、、單色器內壁黑化處理不當。 光柵是雜散光的主要來源，占總雜散光的80%。測定方法：一般采用標準濾光片或10g/L的NaI及NaNO3水溶液。在紫外區(qū)測定220nm(NaI)或340nm(NaNO3)處的透過率%T ，在可見光區(qū)用384mg/L的KMnO4 ，測定525nm處的透過率%T 。第六十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 雜散光與吸光度相對誤差和吸光度真值的關系第六十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月舉例： 比如對某生物酶檢測：假設測定的吸光度為1.95Abs,要求達到1%誤差；儀器的雜散光為0.2%，行不行？ 不行！為什么？因其誤差為3.6%！只有當儀器的雜散

42、光為0.05%,才可達1%! 見前圖。第六十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 不同程度雜散光對比爾定律的偏離0.1%T第七十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噪聲定義： 無樣品時儀器自身的波動。 也就是說：噪聲是疊加在待測量的分析信號中不需要的信號，即零信號上下波動的振幅寬度。重要性： 光度噪聲影響光度測量的靈敏度（信噪比）、精密度和準確度。限制測定濃度的下限，是分析誤差的主要來源。主要來源： 光學系統(tǒng)、光源、檢測器、電子元器件及電路設計等。 噪聲的測定： 在時間掃描方式下，于500nm波長處連續(xù)測量120秒鐘，由所記錄的吸光度時間光譜圖量出峰峰值即為儀器的噪聲。改

43、變儀器的響應時間可改善信噪比。 第七十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 噪聲與吸光度相對誤差和吸光度真值的關系第七十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月四、穩(wěn)定性定義： 是指不放置樣品情況下，零吸收讀數(shù)在一定時間內偏離的程度（1小時內儀器自身的漂移量）。影響穩(wěn)定性的主要因素： 光源（氘燈：電源1%-光6.7%；鎢燈：電源1%-光3.4% ） 光電倍增管(電源1%-放大后的信號12% ) 溫度、環(huán)境等重要性： 同樣是分析誤差的主要來源。影響測定的重現(xiàn)性與準確度，嚴重甚至根本無法測定。測定方法： 在時間掃描方式下，儀器預熱2h，于500nm波長處連續(xù)測量1小時，由所記錄的吸

44、光度時間光譜圖曲線的峰峰值檢查儀器的穩(wěn)定性。第七十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、基線平直度定義： 基線平直度是指不放置樣品情況下，全波段掃描（需先進行全波段范圍基線校正），基線傾斜或彎曲的程度以及各個波長點的光度噪聲（P-P）。原因： 光學系統(tǒng)失調； 參比光束與樣品光束不平衡； 儀器受震、光源位置改變。重要性： 它是各個波長上主要分析誤差的來源之一，平直度不好使樣品吸收光譜中各吸收峰之間的比值發(fā)生變化，給定性分析造成困難。第七十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月六、波長準確度與重復性 波長準確度：多次測量平均值與真值之差。 波長重復性：多次測量值中最大最小值之差

45、。 波長重復性在掃描速度、分光帶寬、吸光度一 致情況下主要體現(xiàn)為儀器機械重復性。 測定方法：用汞燈（546.07nm、253.65nm)、 氘燈(656.1nm、486.0nm) 或者用標準濾色片。 重復單向掃描三次，計算最大差值。 重要性：吸光度是隨波長而變化的，波長準確度、重復性不 合格，何談分析第七十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月七、 光譜帶寬(SBW)定義：譜線的半寬度。 SBW不等于狹縫寬度，關系如下： SBW=d（/mm)b（mm) b狹縫寬度，以mm計。d(/mm)倒線色散率。SBW的重要性：影響光度準確度和分辨率。 如何影響分析測試結果？見下圖：第七十六張，PP

46、T共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月 光譜帶寬與光度準確度的關系第七十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月UV Probe軟件包第七十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月裝置的連接 第七十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月初始化大約需要5分鐘左右，進行一系列的檢查和初置 第八十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月標準工具欄第八十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光譜模塊主要作用是控制分光光度計在一定的波長范圍內掃描，記錄吸收值、透射率、反射率或能量在各波長的讀數(shù)。動力學模塊基本功能是控制分光光度計，觀察在固定波長下吸收值、透射率、反射率或能量

47、隨時間的變化。光度測定模塊基本目是測定樣品中某些物質的濃度。通過手動輸入或分光光度計采集讀數(shù)的方法建立 標準 和樣品數(shù)據(jù)表。建立和查看標準曲線和樣品圖。使用標準曲線或K-因子方程計算未知樣品的濃度值。報告生成器所見即所得地編輯報告第八十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月基線，調零光譜模塊第八十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月1 選擇 窗口 光譜 ，打開光譜模塊。 2 點擊光度計鍵條中的“連接”來連接儀器。 3 點擊光度計鍵條中“基線”來進行基線的初始化操作。 4 當基線參數(shù)對話框彈出時，在開始波長和結束波長中分別輸入700和300。5 點擊“確定”。 注意在基線校正過

48、程中光度計狀態(tài)窗口的讀數(shù)變化。 6 當完成掃描后，點擊輸出窗口的儀器履歷標簽。查看列出的基線校正信息。 列出的基線校正履歷 第八十四張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月點擊菜單欄上的 測定標簽選擇波長測定的范圍、掃描的速度、采樣間隔等。試樣準備標簽，可輸入重量、體積、稀釋因子、光程長等。儀器參數(shù)標簽，可選擇測定種類（吸收值、透射率、能量、反射率）以及通帶（狹逢）等條件。建立數(shù)據(jù)采集方法第八十五張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月Perkin Elmer Instruments (PE)Varian Analytical Instruments(瓦里安)Beckman Coult

49、er Inc (貝克曼) Shimadzu Scientific Instruments ( 島津)Agilent Technologies (安捷倫)OceanOptics (海洋光學)國內外生產廠家上海分析儀器總廠上海棱光天美科學儀器有限公司北京普析通用儀器公司北京瑞利分析儀器公司天津光學儀器廠分光光度計的發(fā)展與現(xiàn)狀第八十六張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月詳細操作方法儀器的聯(lián)機及界面簡介1.插上電源，打開光度計前面的電源開關。2.雙擊計算機桌面UV Probe圖標，打開UVProbe軟件，點擊UVProbe中“Connect”圖標聯(lián)機，出現(xiàn)自檢畫面。3.如自檢完全部綠燈亮，則點

50、擊“OK”進入系統(tǒng)。若出現(xiàn)紅燈亮，可關掉光度計重新連接，若仍未通過自檢，應立即報告儀器負責老師。4.完全通過并進入系統(tǒng)，出現(xiàn)UVProbe菜單欄和工具欄。UVProbe有四大主要模塊，包括光譜掃描模塊、光度測量模塊、時間掃描模塊和報告生成器。每種模式都可以直接點擊后面的方法設定按鈕設置方法。第八十七張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光譜掃描（Spectrum）1.點下光譜掃描圖標，出現(xiàn)光譜掃描界面。2.點擊方法按鈕，出現(xiàn)方法設置對話框。在此可以設置掃描波長范圍，儀器的最大范圍為3200190nm?？梢栽O置掃描速度，一般可選中速（Medium）或快速（Fast）進行掃描。采樣間隔表示光

51、度計每隔多少nm讀一個吸光度值，如沒有特殊要求，選擇自動即可?？蛇x擇是否重復掃描曲線，若重復則設置重復次數(shù)和間隔時間。3.點擊“Sample Preparation”輸入樣品信息。包括樣品的質量、體積、稀釋倍數(shù)和測量光程等。也可以輸入樣品的其他信息。4.點擊“Instrument Parameters（儀器參數(shù)）”設置測量方式和儀器的一些參數(shù)。在測量模式中可選擇“Transmittance（透過率）”、“Absorbance（吸光度）”、“Energy（能量）”和“Reflectance（反射）”，其中Reflectance一般用積分球測定固體樣品時使用。狹縫設置在3200800nm下設為5n

52、m，在800190nm 設為2nm。若包括這兩個范圍的波長如1500500nm則選擇狹縫為5nm。5.換燈和檢測器可根據(jù)所測樣品進行設置，換燈在393282nm范圍內任意值均可，換檢測器在895750nm范圍內任設一個值即可。但換燈和檢測器由于儀器進行機械的移動，會造成信號波動較大，稱儀器噪音大，此時所得掃描曲線誤差較大，所以所設波長應該避免在樣品吸收峰位置以免影響測定值。第八十八張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.所有參數(shù)設置完成后，兩個樣品架均不放置樣品或兩個均放上同樣的空白溶液，點擊“Baseline”，開始進行基線校正，儀器掃描完成后，點擊“ Go To WL”將波長轉到7

53、50nm，點擊“Auto Zero”把750nm的波長設為0。點擊“Start”再次掃描，若得出曲線最值均小于0.001，則認為基線平坦，若數(shù)值較大，則將750nm吸光度設為0重新進行基線掃描。7.基線校正完成后，取出樣品架的空白溶液，放入樣品溶液，點擊“Start”開始掃描曲線。掃描完成后，出現(xiàn)保存路徑框和文件名框，設置好后出現(xiàn)掃描曲線。8.曲線掃描完成后，在譜圖上點擊鼠標右鍵，出現(xiàn)快捷菜單。點擊“Auto Scale”可是軟件自動調節(jié)圖像坐標使之適合掃描所得數(shù)據(jù)。點擊“Cross HairDisplay”鼠標顯示為交叉線，用鼠標將交叉線放到曲線上某點即可顯示該點的波長和吸光度值。9.點擊“

54、Label”可以在譜圖上添加標簽，可在其中輸入文本以標記譜圖。點擊“Legend”出現(xiàn)各數(shù)據(jù)保存圖，若在前面框里勾選該光譜數(shù)據(jù)，則在左面重疊圖上顯示其曲線。10若從右鍵快捷菜單中選擇“Customize（自定義）”，可以自定義曲線顯示顏色還可定義坐標軸的數(shù)值。第八十九張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月11.得出曲線后可以對譜圖進行一系列的處理。(1)點擊“Data Print（顯示數(shù)據(jù)）”圖標可以將譜圖曲線直接顯示為數(shù)值。(2)點擊“Manipulate（運算）”圖標，可以進行加減乘除、差譜、扣除空白、倒數(shù)光譜、對數(shù)光譜等處理。(3)點擊“Peak Point（顯示峰值）”按鈕顯示“

55、波峰”和“波谷”的數(shù)值。(4)點擊“Point Pick”圖標，輸入要顯示的波長值，立即顯示出所輸入波長處的吸光度值。(5)點擊“Peak Area”，設定峰閾值，即顯示大于此閾值的峰區(qū)域。(6)點擊“Sewing box（裁縫）”圖標，可以進行譜圖的裁剪和縫合。12.光譜曲線掃描完成后數(shù)據(jù)實際直接保存在內存中，并沒有保存到硬盤上，此時若關閉窗口，電腦會提示“Some Spectrum data has not been saved! Do you still want to exit and lost unsaved change？（還有光譜數(shù)據(jù)尚未保存，你是要離開而不保存數(shù)據(jù)嗎？）”選擇“

56、No”返回主界面保存所有數(shù)據(jù)。第九十張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月光度測量（Photometric）1.點下“Photometric”圖標，出現(xiàn)光度測量的選擇圖標和方法設置按鈕。2.點擊“Method”按鈕設置方法，在“Wavelength（波長選擇）”中選擇點測量（Point）或范圍（Range）測量。范圍測量可以選擇以某一段波長范圍內的峰值、谷值、最大、最小或面積值作為標準曲線的點。3.以“Point”為例，點擊“下一步”，在“Type”中選擇單點、多點曲線。在“Formula（公式）”中選擇“Fixed Wavelength”（固定波長）、并選擇濃度單位。4.在對話框中選擇

57、數(shù)據(jù)獲取方式，可以通過儀器測量，也可通過手動輸入值。在“Sample”中輸入每種相同濃度的標準溶液的個數(shù)（如每個樣品都重復一次，則輸入“2”），注意這里所說的Sample（樣品）表示作標準曲線的樣品，而不是將要測定的未知樣。5.點擊“下一步”，同4一樣設置未知樣的個數(shù)。6.點擊“下一步”輸入樣品保存路徑文件名、標題、分析者以及對實驗的注釋。第九十一張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月7.點擊“完成”完成對方法的設定。出現(xiàn)方法對話框，以后點擊工具欄的也可出現(xiàn)此對話框，并可以直接修改參數(shù)設置。8.填充標準表。點擊標準表的任何位置激活標準表。，在表中輸入“Sample ID（樣品ID）”和“

58、Conc（濃度）”，點擊空白框出現(xiàn)下一行。數(shù)據(jù)來源若選擇“User Entry（用戶輸入）”則可以在 “WL800”等列內輸入吸光度值。若選擇的是“Instrument（儀器測量）”則只能輸入樣品ID和濃度。9.輸入完成后，可以讀取標準樣品的數(shù)據(jù)。將標準樣品依次放入樣品室。點擊“Read Std”開始測量。（注：當顯示下列信息時，請點擊“確定”?！癟here is no associated blank for this standard. Do you wish to continue(該標準物相應的空白，是否繼續(xù))？”）。分光光度計將分別測定個波長的吸光度值，UVProbe將自動添加所測各

59、值和計算結果與標準表中。10.可以改變曲線級數(shù)，同時曲線形狀發(fā)生改變。點圖標，選“Calibration ”，在其中的“Order of”后的下來框中選擇需要的級數(shù)。第九十二張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月11.選擇“FileSave As”輸入文件名保存標準表。12.同輸入標準表的方法，在“Sample Table（樣品表）”中輸入樣品ID。13.點擊“ Go To WL”設置測量需要的波長，點擊“Read Unk”測定未知樣，如此反復，測量所有的未知樣值。 濃度由標準曲線獲得。14.得出標準曲線后，在曲線圖上點擊右鍵，選擇“Properties（屬性）”出現(xiàn)統(tǒng)計（Statist

60、ics）顯示框。勾選要顯示的選項，在標準曲線的左下方即顯示對應的統(tǒng)計結果。15.對標準曲線進行四則運算和倒數(shù)、對數(shù)、A/T轉換。在工具欄里點擊按鈕，在“Arithmetic”中進行“加減乘除”等操作。在“Transforms（轉換）”框中進行倒數(shù)、對數(shù)、A/T轉換。在“Column Name”中輸入列名，在“Source Column”中選擇要進行轉換的數(shù)據(jù)行。在“Operator”中選擇轉換方法，其中倒數(shù)為“1/Y”、對數(shù)為“Log 10”、A/T轉換為“AbsT TAbs”。16.點擊，在出現(xiàn)的界面上選擇可以自定義公式進行計算。第九十三張，PPT共一百零一頁，創(chuàng)作于2022年6月動力學測量