學習2015-分離10毛細管電泳

1、2022/9/31高效毛細管電泳分析High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE)2022/9/32一、概述Generalization二、經(jīng)典電泳分析法Traditional electrophoresis三、高效毛細管電泳分析法High performance capillary electrophoresis第一節(jié)概 述Generalization2022/9/33一 .概述 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同

2、，可實現(xiàn)分離。 1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學獎生物化學家蒂塞利烏斯 A.W.K.蒂塞利烏斯 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (19021971） 蒂塞利烏斯1925年從事膠體溶液中懸浮蛋白質(zhì)的電泳分離研究。曾自制超速離心機測定蛋白質(zhì)分子的大小和形狀,并與斯韋德貝里合作發(fā)表了第一篇論文,報道了測定蛋白質(zhì)淌度的新方法。1930年他進一步

3、改進實驗手段和裝置,發(fā)表了關(guān)于色譜法和吸附的論文。1935年改建原有電泳裝置,發(fā)展了區(qū)帶電泳法,大大提高了效率和分辨率。1940年他用自己設計的新電泳裝置成功地分離了血清中蛋白質(zhì)的4個組分,分別命名為:白蛋白、和球蛋白。該法迅速應用于分離和鑒定各種復雜蛋白質(zhì)及其他天然物質(zhì)的混合物的組成。他因?qū)﹄娪痉治龊臀椒椒ǖ难芯?特別是發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分而獲得1948年諾貝爾化學獎。 2022/9/36二.經(jīng)典電泳分析 利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)

4、電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細管電泳。2022/9/37三.高效毛細管電泳分析高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進： 一是采用了50m (0.05mm)內(nèi)徑的毛細管, 二是采用了高達數(shù)千伏的電壓。 毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加， 高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液

5、相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。2022/9/38高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化 電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù).3.操作方便、消耗少 進樣量極少，水介質(zhì)中進行.4.應用范圍極廣 有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等. 2022/9/39一、PHCE基本原理Basic principles of PHCE二、電滲現(xiàn)象與電滲流Electroosmosis and

6、 electroosmotic flow三、影響電滲流的因素Factors influenced electroosmosis四、淌度Mobility五、PHCE中的參數(shù)與關(guān)系式Parameters and relation in HPCE六、影響分離效率的因素Factors influenced separation efficiency第二節(jié)高效毛細管電泳理論基礎basic theory of HPCE2022/9/310 一、高效毛細管電泳(HPCE)基本原理 Basic principles of PHCE 電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些

7、因素有關(guān)？ 當帶電離子以速度 在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE = qE 阻 力：F = f故： qE = fq離子所帶的有效電荷；E 電場強度；離子在電場中的遷移速度；f 平動摩擦系數(shù) ( 對于球形離子： f =6； 離子的表觀液態(tài)動力學半徑； 介質(zhì)的粘度； )2022/9/311所以，遷移速度：（球形離子） 物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。淌度 ：單位電場強度下的平均電泳速度。 q 離子所帶的有效電荷； 離子的表觀液態(tài)動力學半徑； 介質(zhì)的粘度； 2022/9/312二、電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosis and el

8、ectroosmotic flow1.電滲流現(xiàn)象 當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。 當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 2022/9/3132.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流 石英毛細管柱，內(nèi)充液pH3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。 在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶

9、劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度電滲流。2022/9/3143.HPCE中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取決于電滲淌度和電場強度E。即 電滲流 = E電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即 = 00真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細管壁的Zeta電勢。 電滲流 = 0 E實際電泳分析，可在實驗測定相應參數(shù)后，按下式計算 電滲流 = Lef/teoLef 毛細管有效長度； teo電滲流標記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。2022/9/315HPCE中電滲流的方向 電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表

10、面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極； 石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法： （1）毛細管改性 表面鍵合陽離子基團； （2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。2022/9/3164. HPCE中電滲流的流形 電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）； 液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。2022/9/3175. HPCE中電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的57倍； 各種電性離

11、子在毛細管柱中的遷移速度為： + =電滲流 + +ef 陽離子運動方向與電滲流一致； - =電滲流 - -ef 陰離子運動方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。2022/9/318三、HPCE中影響電滲流的因素 factors influenced electroosmosis1.電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛

12、細管材料的影響 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；2022/9/3193. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響 對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大； pH3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。2022/9/3202022/9/3214.

13、 溫度的影響 毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”； 焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量； HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。 溫度每變化1C，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%3%；2022/9/3225. 添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向； 加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑

14、如甲醇、乙腈，會降低離子強度，Zeta電勢減小， 使電滲流降低。 2022/9/323四、淌度 mobility 淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度； 淌度不同是電泳分離的基礎。1.絕對淌度(absolute mobility)ab 無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚?。2.有效淌度(effective mobility)ef 實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。 ef=aii ai 溶質(zhì)i 的解離度；i 溶質(zhì)i 在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度 ap 離子在實際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）： ap=ap E ap = ef + eo2022

15、/9/324五、HPCE中的參數(shù)與關(guān)系式 parameters and relation in HPCE1.遷移時間（保留時間） HPCE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V外加電壓；L毛細管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)） 在HPCE中，僅存在縱向擴散，2=2Dt 擴散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。2022/9/3253.分離度 影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：2022/9/326六、影響分離效率的因素區(qū)帶展寬 factors influenced the efficien

16、cyband broadening 1.縱向擴散的影響 在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：2=2Dt 由擴散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進樣的影響 當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度： Winj= (24D t )1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%2%。2022/9/3273.焦耳熱與溫度梯度的影響 電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計算：m電解質(zhì)溶液的摩爾電導；I工作電流：cm電解質(zhì)濃度； 散熱過程中，在毛細管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區(qū)帶展

17、寬。 改善方法： （1）減小毛細管內(nèi)徑；(2）控制散熱；2022/9/3284.溶質(zhì)與管壁間的相互作用 存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬； 蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。 細內(nèi)徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機會。 減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導，對電滲流影響不大。2022/9/3295.其他影響因素 （1）電分散作用對譜帶展寬的影響 當溶質(zhì)區(qū)帶與

18、緩沖溶液區(qū)帶的電導不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的影響 一般情況下，HPCE中不存在層流，但當毛細管兩端存在壓力差時，出現(xiàn)拋物線形的層流； 產(chǎn)生的原因：毛細管兩端液面高度不同。 實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。2022/9/330一、高效毛細管電泳儀high performance capillary electrophoresis apparatus二、流程與主要部件process and main assembly三、進樣方式injection method第三節(jié)高效毛細管電泳儀high performance

19、 capillary electrophoresis apparatus2022/9/331一、高效毛細管電泳儀high performance capillary electrophoresis apparatus2022/9/332儀器22022/9/333儀器32022/9/334P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis 美國貝克曼庫爾特公司2022/9/335二、儀器流程與主要部件 process and main assembly 電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-1910-21 mol/L）202

20、2/9/3361.高壓電源（1）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2. 毛細管柱 （1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長度電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。 最基本、應用廣的分離模式；2022/9/342二、毛細管凝膠電泳 Capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類

21、似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。2022/9/343 1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。三、 膠束電動毛細管色譜（MECC ，MEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在電場

22、力的作用下，膠束在柱中移動。2022/9/344 2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動； 5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。 3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長； 4.可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2022/9/345 在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定相，或在管內(nèi)填充固定相，根據(jù)溶質(zhì)在固定相和流動相中的分配系數(shù)的不同和自身的電泳淌度差異得以分離四、 毛細管電色譜(CEC ) Capillary electrochromatography2022/9/346幾種主要類型開管毛細

23、管電色譜柱OT-CEC 填充毛細管電色譜柱 P-CEC整體毛細管電色譜柱ML-CEC 2022/9/347填充毛細管電色譜柱P-CEC是最早研究的，其填料巨大的比表面使其對污染不敏感，分析結(jié)果的重現(xiàn)性較好，但因其填充及制備柱兩端塞子的困難，以及由此帶來的氣泡效應和塞子效應等阻礙了它的進一步發(fā)展。但人們至今仍在努力并取得可喜進展 。2022/9/348開管毛細管電色譜柱OT-CEC柱中無塞子和填料，氣泡效應和渦流擴散的影響小，分析中可獲得較高柱效，適用于混合物的快速分析，但其相比小，柱容量低，壽命短，使其應用亦受到一定限制。2022/9/349化學鍵合物理吸附2022/9/350整體毛細管電色譜

24、柱ML-CEC通過在毛細管內(nèi)原位聚合或固化的方法制成具有均一多孔結(jié)構(gòu)的整體式柱床，使毛細管柱的制備比較簡單，且無塞子效應.制備反應1cm 1cm2022/9/352SEM表征2022/9/353 1. 根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；五、毛細管等電聚焦 Capillary isoelectric

25、focusing，CIEF2022/9/354 4. 聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離； 5. 陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6. 加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測； 7. 電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。2022/9/355一、離子分析 analysis of ion陽離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子； 陽極進樣，陰極檢測； 具有很高的靈敏度； 第五節(jié) 應用與進展2022/9/356陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；離子價態(tài)及存在形態(tài)分析；2022/9/357二、藥物分析