分子生物學(xué)-074生物信息的傳遞4rna拼接2rna

1、3.7.5+內(nèi)含子剪接RNA splicing分子生物學(xué)講義山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院General sequence of steps in the formation of eukaryotic mRNA內(nèi)含子注意5加帽的時間注意內(nèi)含子外顯子一般是在RNA水平描述的四種典型內(nèi)含子的邊界序列特征類型5拼接點(diǎn)內(nèi)含子3拼接點(diǎn)剪接方式化學(xué)本質(zhì)tRNA類無保守序列富含AU無保守序列蛋白酶參與直接切割和連接I類自剪U有可供識別的特異序列G自我剪接轉(zhuǎn)脂反應(yīng)II類自剪GUGCGAUGUAG類真核mRNAGU AUAGAC剪接裝置復(fù)雜剪接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白、小RNA組成形成特定的二級結(jié)構(gòu)，RNA具有催化

2、剪接的能力一、tRNA內(nèi)含子的剪接tRNA的拼接特點(diǎn)（酵母為例） 1、鏈的斷裂和連接是兩個獨(dú)立的過程 2、tRNA的內(nèi)含子均位于反密碼環(huán)的3端， 長1416bp，其中含一段與反密碼環(huán)互補(bǔ)的序列 反密碼環(huán)處形成一個與成熟tRNA不同的構(gòu)象 3、拼接酶系識別的就是這個二級結(jié)構(gòu)tRNA splicing分解過程內(nèi)含子RNA連接酶連接斷端其中，內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生 5OH 和 3磷酸，3磷酸端很快轉(zhuǎn)變?yōu)?，3環(huán)式核苷酸內(nèi)切酶作用一個半分子有兩個磷酸末端，另一個半分子有兩個 OH末端因此，一個半分子有兩個磷酸末端，另一個半分子有兩個 OH末端OHPPtRNA splicing分解過程連接反應(yīng)前要進(jìn)行兩個反應(yīng)

3、： a、左邊外顯子的3端成為OH （環(huán)式磷酸二酯酶） 其 3 位為OH， 2 位為磷酸b、第二個外顯子的 5端轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸基（多聚核苷酸激酶）因此 連接后還要切除第一個外顯子的 2磷酸 這是 tRNA內(nèi)含子拼接重要特點(diǎn)之一RNA splicing23145tRNA splicing分解過程罕見的rRNA內(nèi)含子一類自剪內(nèi)含子的剪接 類自剪內(nèi)含子的拼接 特點(diǎn)： 1 拼接屬于自我拼接 2 內(nèi)含子自身形成明顯的二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1） 5 拼接點(diǎn)和3 拼接點(diǎn)UA G RNA splicing 2（2） 有由保守序列形成的二級結(jié)構(gòu) a、 保守序列為 5 PQRS3 距拼接點(diǎn)很遠(yuǎn)，各 1012bp P與

4、Q互補(bǔ)、R與S互補(bǔ)而形成中部核心結(jié)構(gòu)RNA splicing2 b、 二級結(jié)構(gòu)中還包括內(nèi)含子與外顯子的某一序列互補(bǔ)所形成的二級結(jié)構(gòu) 內(nèi)部引導(dǎo)序列（interal guide sequence IGS）：內(nèi) 含子中能與兩個拼接點(diǎn)邊界序列配對的一段序列 # 第一類內(nèi)含子的拼接依賴于以上二級結(jié)構(gòu) 為自我拼接的進(jìn)行提供活性位點(diǎn)RNA splicing2內(nèi)部引導(dǎo)序列內(nèi)部保守 PQ內(nèi)部保守SR內(nèi)含子自身能形成特定的二級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生適于拼接反應(yīng)的構(gòu)象和活性位點(diǎn)(內(nèi)部引導(dǎo)序列IGS),在G的參與下完成拼接反應(yīng)活性中心 2、 拼接機(jī)制（以四膜蟲的大rRNA前體的拼接為例） （1） 兩種rRNA轉(zhuǎn)錄在一條35S的產(chǎn)

5、物中，26SrRNA 有內(nèi)含子 （2） 35SRNA體外有自我拼接的能力 反應(yīng)需要：游離的G【鳥苷酸輔助因子（GTP GDP GMP和鳥嘌呤核苷）】 不需能量的供給 （3） 拼接反應(yīng)后，G與內(nèi)含子（414b） 5端以磷酸二酯鍵相連 （放射性標(biāo)記試驗(yàn)） 5 U G 3 小rRNA 大rRNA（26S）內(nèi)含子具體的拼接過程 1、游離G發(fā)動的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，G 的 3-OH 攻擊內(nèi)含子的 5拼接點(diǎn)2、exon A 的3-OH 攻擊3拼接點(diǎn)，同時釋放線狀的內(nèi)含子,形成成熟RNA分子rRNA splicing完整過程游離3OHExon AExon AExon BExon B游離G-OHUGU-OHGGExon

6、 AExon BGGPage107 圖3-31 兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是緊密偶聯(lián)的 釋放出的內(nèi)含子可繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 而形成環(huán)狀 RNA splicing2（5）第I類內(nèi)含子的自我拼接的最大特點(diǎn)：自我拼接過程主要由轉(zhuǎn)酯反應(yīng)構(gòu)成，且完全由內(nèi)含子自身完成RNA splicing2核酶的（發(fā)現(xiàn)的）生物學(xué)意義Self-splicing is not an enzyme activity, because the RNA is not regenerated in its original form at the end of the reaction. However, the discovery of rib

7、ozymes (catalytic RNAs) has significantly altered ourview of the biochemistry involved in the origin of life插播核酶的發(fā)現(xiàn) page1103、內(nèi)含子的催化功能核酶的發(fā)現(xiàn) 35SRNA前體拼接釋放的內(nèi)含子（414base）進(jìn)行的自身轉(zhuǎn) 酯反應(yīng) （1）線狀分子自身環(huán)化能力及環(huán)化后的逆環(huán)化RNA splicing從前面舉的這個例子中，我們能夠看出來：在原生動物四膜蟲（tetrahymena）中，26S rRNA分子是由一個6.4kb的前體經(jīng)切除1個414nt的內(nèi)含子后形成的,在此過程中, RN

8、A進(jìn)行了自我剪接（self-splicing），但是要有鳥嘌呤存在的條件下通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)實(shí)現(xiàn). RNA催化作用的發(fā)現(xiàn)提示了生命的最初形式可能是兼遺傳信息載體和催化功能于一身的RNA. RNA自身在三個反應(yīng)中顯示了酶的催化作用總的機(jī)制Self-splicing reaction for the group I intron in Tetrahymena pre-rRNA拼接反應(yīng)中，“酶” 和底物是同一個分子，且反應(yīng)后變成了不同的分子某些真核生物細(xì)胞器基因中二類自剪內(nèi)含子的剪接類內(nèi)含子的自我剪接總的過程第二類內(nèi)含子的拼接 GUAU類 1、拼接點(diǎn)序列結(jié)構(gòu)特征 7核苷酸的保守序列 （分枝點(diǎn)Branch

9、Site ） 3 拼接點(diǎn)上游 6bp 12bp 處 5exon GUGCGPy AU exon3 供點(diǎn)受點(diǎn)Py Pu Py Py U A Py- 100% RNA splicing 分解過程2 在Branch Site 的兩側(cè)存在一些短的序列， 與其上游10-50Nt處互成 IR,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(但A 不包含在 IR序列內(nèi), 從而被排除成芽狀突起） 5-GUGCGPyPuPyPyUAPyPyAU3Intron IR IR 5 G AU 3 ARNA splicing 3IRIRRNA splicing 3真核mRNA類的內(nèi)含子大多數(shù)真核生物核基因的mRNAGUAG類內(nèi)含子的剪接GUAG類的五、核

10、基因mRNA內(nèi)含子的拼接 比如產(chǎn)生小分子RNA, 每個細(xì)胞有 105106個 snRNA： 細(xì)胞核中的 （snRNP） scRNA： 細(xì)胞質(zhì)中的 （scRNP） 2、核mRNA內(nèi)含子拼接的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 內(nèi)含子拼接與其他加工同時進(jìn)行RNA splicing拼接點(diǎn)序列 符合Chambon rule （GUAG規(guī)則） 5-exon- GU-intronAG exon-3供點(diǎn) 100% 94% 受點(diǎn) 7Nt branch site 3拼接點(diǎn)的上游 py X py U pu A pyRNA splicingPage102 ，103 3、拼接機(jī)制 SnRNA (or ScRNA) 與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域

11、并參與剪接, 形成拼接體( spliceosome)。 Spliceosome 逐級組裝， SnRNA（U1、U2、U5和 U4U6）分步替代 U1通過與 5拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合 U2識別并結(jié)合分支 點(diǎn)A U1和U2作用使內(nèi)含子的 5端和 3端帶到 一起（U1與 3拼接點(diǎn)配對） U1、U2、mRNA與 U4U5U6復(fù)合物形成一個完整的拼接體RNA splicingGU-AG類內(nèi)含子結(jié)構(gòu)嘧啶富含區(qū)5剪接位點(diǎn)3剪接位點(diǎn)內(nèi)含子分枝點(diǎn)保守殘基A內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)拼接點(diǎn)： 5 剪接點(diǎn)或左剪接點(diǎn)（內(nèi)含子上游） 3 剪接點(diǎn)或右剪接點(diǎn)（下游） Breathnach-Chambon rule （GUAG規(guī)則） 第一次轉(zhuǎn)酯

12、左外顯子、內(nèi)含子剪切套索套索 第二次轉(zhuǎn)酯exons連接、套索狀內(nèi)含子釋放 拼接體（spliceosome） 解體與lariat降解同步RNA splicing剪接機(jī)制（清晰版）圖3-28剪接機(jī)制（簡化版）第一次轉(zhuǎn)酯左外顯子、內(nèi)含子剪切套索第二次轉(zhuǎn)酯exons連接、套索狀內(nèi)含子釋放剪接體解體與套索降解同步此類內(nèi)含子的拼接最大的特征是形成復(fù)雜的拼接體，涉及到多種蛋白質(zhì)和小RNA參與Splicing occurs in a “spliceosome” an RNA-protein complexpre-mRNAspliced mRNAspliceosome(100 proteins + 5 smal

13、l RNAs)snRNA（核內(nèi)小分子RNA）snRNP（與snRNA結(jié)合的核蛋白）一個snRNA的結(jié)構(gòu)（顯示與外顯子內(nèi)含子拼接點(diǎn)的結(jié)合）催化物質(zhì)蛋白酶核酶核酶蛋白，RNA總結(jié)幾種不同內(nèi)含子剪接反應(yīng)的區(qū)別酵母tRNAI類內(nèi)含子類內(nèi)含子核mRNA前體邊界序列無5U-G35GU-G/U35 GU-AG3特殊序列C（莖上）G(環(huán)上)內(nèi)部引導(dǎo)順序分支點(diǎn)順序分支點(diǎn)順序5 外顯子序列二級結(jié)構(gòu)莖環(huán)構(gòu)象核心結(jié)構(gòu)6個功能區(qū)剪接體基因外的成分內(nèi)切酶，連接酶GTP，鎂離子鎂離子U1,U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中間型分子半分子tRNA環(huán)狀L-19套索套索催化類型異體催化自體催化自體催化半自體催化反應(yīng)

14、本質(zhì)酶切連接反應(yīng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)3.8 RNA編輯RNA編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。是在mRNA水平上發(fā)生信息變化的過程。是指修飾或輕微改變mRNA的核苷酸順序，使它們與對應(yīng)的模板DNA的順序有所不同的過程page108An example of C-to-U editing is with the apolipoprotein B gene in humansA-to-I editing is the main form of RNA editing in mammals RNA編輯RNA編輯的 生物學(xué)意義：1、校正作用校正基因突

15、變造成的遺傳信息的丟失2、調(diào)控作用通過編輯可以構(gòu)建或者去除起始密碼子和終止密碼子，這是基因表達(dá)調(diào)控的一種方式3、擴(kuò)充遺傳信息可以使得基因產(chǎn)物獲得新的結(jié)構(gòu)和功能，有利于生物進(jìn)化RNA編輯的新的生物學(xué)意義為在非編碼區(qū)出現(xiàn)ORF(open reading frame)提供可能RNA編輯在內(nèi)含子剪接中可能起作用在理論上否定了通用密碼子的例外現(xiàn)象RNA編輯功能的發(fā)現(xiàn)有助于對核基因調(diào)控線粒體基因表達(dá)的認(rèn)識？RNA編輯現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對分子生物學(xué)的一個基本原則提出了挑戰(zhàn)，也為基因表達(dá)的修正提供了一種機(jī)制。 遺傳信息是否都存在于基因序列中？指導(dǎo)編輯的遺傳信息是什么？C變?yōu)閁堿基的突變apolipoprotein 組

16、織特異性？RNA編輯的機(jī)制向?qū)NA（guiding RNA）指導(dǎo)的堿基的插入或者缺失向?qū)NA：在RNA編輯中提供模板的RNA，其基因通常與被編輯的RNA的基因排列在一起，是獨(dú)立編碼的。CyB-1 CyB-2 MURF3 Coll舉例：利什曼原蟲CyB基因基因CyB-1CyB-2向?qū)NA基因注意轉(zhuǎn)錄方向The Leishmania genome contains genes coding for pre-edited RNAs interspersed with units that code for the guide RNAs required to generate the corr

17、ect mRNA sequences教材109頁3.8.2 RNA的再編碼mRNA在某些情況下不是以固定的方式被翻譯，而是可以改變原來的編碼信息，以不同的方式進(jìn)行翻譯，科學(xué)上把RNA編碼和讀碼方式的改變成為RNA的再編碼 核糖體跳躍333111555777999核糖體正常情況下沿著mRNA上的三聯(lián)體密碼子順序前進(jìn)； 特殊情況下，發(fā)生+1或者-1，甚至跨過若干色核苷酸發(fā)生跳躍； 通?？邕^終止密碼而“通讀”不連續(xù)翻譯讀閱讀框 （ORF）不連續(xù)轉(zhuǎn)錄和反式拼接Discontinuoustranscription and Trans-splicing補(bǔ)充內(nèi)容 順式拼接： 通過拼接將一個RNA分子的內(nèi)含子

18、拼接掉，使外顯子連接在一起（cis-splicing） 反式拼接： 發(fā)生在兩個RNA分子之間的拼接（trans-spling） 一、不連續(xù)轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn) 1982 Vander Ploeg等人 研究錐蟲的可變表面糖蛋白基因時發(fā)現(xiàn) 在其mRNA的 5端有35個 bases 是其基因中所沒有的 錐蟲的全部mRNA都含有這個 35bases 序列 稱其為前導(dǎo)序列（leader sequence）補(bǔ)充內(nèi)容 1、 前導(dǎo)序列 由位于基因組其它區(qū)域的連續(xù)重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來 200 copies左右 每個重復(fù)單位的 3端還有100base 的一段序列（內(nèi)含子） 因此 一種完整 mRNA 的前導(dǎo)序列及特異基因編碼的 mRNA序列 部分的轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)