MN9D多巴胺能細(xì)胞損傷模型的建立基

1、MN9D多巴胺能細(xì)胞毀傷模型的創(chuàng)坐基鈕洪素張教文劉淮東下殿帥【摘要】目的創(chuàng)坐離體多巴胺(dpain，DA)能神經(jīng)細(xì)胞系N9D細(xì)胞毀傷模型。要收離體細(xì)胞做育前提下，于做育液中參減好別濃度6-羥基多巴胺(6-hydrxydpaine，6-HDA)做用于N9D細(xì)胞30in。24h后，TT比色法檢測(cè)N9D細(xì)胞的存活率、Hehst33258核染色戰(zhàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)N9D細(xì)胞的凋亡變革。成果6-HDA以濃度依好性的要收惹起N9D細(xì)胞的凋亡，招致細(xì)胞存活率消沉。200l/L濃度的6-HDA做用30in、做育24h后，N9D細(xì)胞的存活率消沉至68.8%左右，凋亡率刪下至約37.8%。結(jié)論6-HDA可以年夜要惹起

2、N9D細(xì)胞的存活率消沉，而凋亡率刪下，收逝世相似帕金森病時(shí)的DA能神經(jīng)細(xì)胞毀傷的暗示?！鹃]鍵詞】多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞;6-羥基多巴胺;N9D細(xì)胞;帕金森病Abstrat:bjetiveTestablishtheellinjurydelfdpainergielllineN9Dinvitr.ethdsN9Dellsereexpsedtdifferentnentratinsf6-hydrxydpaine(6-HDA)fr30ininvitr,and24hlater,thesurvivalfN9DellsasdetetedithTThratetry,andtheN9Dellsapptsisasdeteri

3、nedithHehst33258stainingandflytetry.Results6-HDAausedtheapptsisfN9Dellsinanentratin-dependentanner:thesurvivalratefellsdereasedapprxiatelyt68.8%hiletheappttiperentagefellsinreasedt37.8%24haftera30inexpsuret200l/L6-HDA.nlusin6-HDAuldindueandereaseinthesurvivalratefN9DellsandaninreaseinthEirapptsisper

4、entage,ausinganinjurytN9DellsinvivinafrsiilarttheinjurydelfdpainergineurnsinParkinsnsdisease(PD).Keyrds:dpainergiells;6-HDA;N9Dells;Parkinsnsdisease帕金森病(Parkinsnsdisease,PD)是以中腦烏量致稀部(substantianigraparspata,SN)多巴胺(DA)能神經(jīng)細(xì)胞停頓性退變成慌張病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)徐玻PD模型是PD底子研討的慌張前提。經(jīng)由過(guò)程年夜腦坐體定位打針神經(jīng)毒物6-羥基多巴胺(6-HDA)或背腔打針甲基苯基四氫

5、吡啶(1-ethyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrpyridine,PTP)是制做PD模型的經(jīng)常使用要收。N9D細(xì)胞是一種由胚胎小鼠中腦頂蓋的DA能神經(jīng)細(xì)胞戰(zhàn)N18TG2神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞交融而成的細(xì)胞系，因?yàn)榭梢阅暌挂磉_(dá)酪氨酸羥化酶(tyrsinehydrxylase,TH)，而且可以年夜要分解、釋放及吸與DA1-3，果此被廣泛利用于DA能神經(jīng)細(xì)胞毀傷模型的研討，那些細(xì)胞也用于PD與DA能神經(jīng)元喪得有閉的機(jī)制及醫(yī)治的研討4。6-HDA是一種神經(jīng)毒素，因?yàn)槠錁?gòu)制與DA相似，常被誤做為神經(jīng)遞量攝進(jìn)到神經(jīng)元內(nèi)，經(jīng)由過(guò)程啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡路子而挑選性惹起DA能神經(jīng)細(xì)胞逝世亡、缺得

6、5-6。如古，利用N9D細(xì)胞創(chuàng)坐離體前提下DA能神經(jīng)細(xì)胞的毀傷模型，經(jīng)網(wǎng)上搜刮海內(nèi)已睹此類研討文獻(xiàn)。本研討正在離體細(xì)胞做育前提下，于做育液中參減好別濃度的6-HDA做用于N9D細(xì)胞30in，24h后，沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察N9D細(xì)胞的存活率、凋亡率及與6-HDA做用濃度的閉連，挑選得當(dāng)?shù)?-HDA濃度，創(chuàng)坐沒(méi)有變的離體細(xì)胞毀傷模型，以收逝世相似于PD細(xì)胞內(nèi)毀傷的形式。1材料戰(zhàn)要收1.1N9D細(xì)胞戰(zhàn)試劑N9D細(xì)胞由國(guó)皆醫(yī)科年夜教惠贈(zèng)。DE/F12、胎牛血渾、6-HDA、維逝世素、TT、Hehst33258染色劑戰(zhàn)金屬離子螯開(kāi)劑(diethylenetriainepentaaetiaid,DETAPA

7、)購(gòu)自Siga公司，AnnexinV-FIT/PI凋亡試劑盒購(gòu)自專蘊(yùn)逝世物試劑。1.2N9D細(xì)胞做育N9D細(xì)胞用露10%胎牛血渾(FBS)的DE/F12做育液做育，而且露有1105U/L青霉素及100g/L鏈霉素。常規(guī)蘇醉N9D細(xì)胞，傳23代后利用于嘗試。將細(xì)胞消化、傳代，以15108/L接種于所需的做育板中，置37、5%2平衡干度的尺度做育箱內(nèi)做育。1.36-HDA的配制戰(zhàn)處置懲獎(jiǎng)利用露0.15%維逝世素戰(zhàn)金屬離子螯開(kāi)劑(DETAPA,10l/L)的無(wú)菌火配制濃度為10l/L的6-HDA母液7。細(xì)胞接種于所需的做育板中，正在賜與6-HDA處置懲獎(jiǎng)前做育液變動(dòng)為無(wú)血渾的做育基。6-HDA母液被

8、進(jìn)一步稀釋，正在做育液中的末濃度為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000l/L，參減到各個(gè)孔中，并設(shè)一般比較組(ntrlgrup)戰(zhàn)溶劑比較組(Vehilegrup)。一般比較組沒(méi)有予任那邊置懲獎(jiǎng)，溶劑比較組僅賜與等量用于配制6-HDA的維逝世素戰(zhàn)金屬離子螯開(kāi)劑的無(wú)菌火。30in后，以無(wú)血渾的做育液洗細(xì)胞2次，變動(dòng)露血渾的DE/F12繼盡做育24h8。1.4TT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞接種于96孔板賜與好別處置懲獎(jiǎng)，各組細(xì)胞繼盡做育24h后每孔參減20lTT(5g/L、PBS配制)。繼盡做育4h后細(xì)致吸去局部液體，參減200l兩甲基亞砜(diethyl

9、sulfxide,DS)充分消融，37靜置0.5h。酶標(biāo)儀570n檢測(cè)光稀度(D)值，策畫(huà)細(xì)胞存活率(即每組D值/一般比較組D值100%=該組的細(xì)胞存活率)。1.5Hehst33258核染色沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察凋亡細(xì)胞形狀細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞做育及6-HDA的處置懲獎(jiǎng)同上。24h后吸去做育液，每孔參減200l3.7%的甲醛(PBS配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫結(jié)實(shí)20in。吸去結(jié)實(shí)液，PBS洗細(xì)胞2次。每孔參減100l的Hehst33258染液(10g/L、PBS配制)，室溫躲光染色515in，正在2010倍隱微鏡下每組挑選5個(gè)視家計(jì)數(shù)，策畫(huà)細(xì)胞凋亡率，留意躲開(kāi)做育孔的周圍天區(qū)。1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)

10、細(xì)胞凋亡率細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞做育及6-HDA的處置懲獎(jiǎng)同上。24h后吸去做育基，0.25%胰卵黑酶消化，PBS洗細(xì)胞2次，每管參減0.5lAnnexinV-FIT/PI凋亡試劑盒中的1annexin連開(kāi)緩沖液重懸細(xì)胞，將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到公用試管內(nèi)。每管參減5l的AnnexinV-FIT戰(zhàn)10l的PI。室溫躲光5in，上機(jī)檢測(cè)N9D細(xì)胞凋亡率。1.7統(tǒng)計(jì)教處置懲獎(jiǎng)局部數(shù)據(jù)以s暗示，采納SPSS13.0硬件停頓統(tǒng)計(jì)教處置懲獎(jiǎng),每組數(shù)據(jù)最少?gòu)?次自力的嘗試中獲得,組間比較采納最小隱著好(LSD)法，P0.05為好別有統(tǒng)計(jì)教意義。2成果2.1好別濃度6-HDA處置懲獎(jiǎng)對(duì)N9D細(xì)胞存活率的影響TT法

11、檢測(cè)成果暗示，N9D的存活率與6-HDA的毀傷做用呈濃度依好性閉連，跟著6-HDA濃度的刪減N9D細(xì)胞的存活率緩緩降降(表1)。好別濃度的6-HDA組與一般比較組比較，好別均有統(tǒng)計(jì)教意義，而溶劑比較組與一般比較組之間好別無(wú)統(tǒng)計(jì)教意義。表16-HDA對(duì)N9D細(xì)胞存活率的影響(n=5)與一般比較組比較：*P0.012.2好別濃度6-HDA惹起N9D細(xì)胞凋亡的變革Hehst33258核染色成果暗示，跟著6-HDA濃度的刪減，具有凋亡形狀的N9D細(xì)胞緩緩刪減(圖1)。凋亡的細(xì)胞核固縮、碎裂，熒光隱微鏡下可睹濃染致稀的顆粒狀熒光(如箭頭所示)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)教處置懲獎(jiǎng)，各濃度6-HDA組的細(xì)胞凋亡率與一般比較組

12、比較，好別均有統(tǒng)計(jì)教意義，而溶劑比較組與一般比較組之間好別無(wú)統(tǒng)計(jì)教意義。AnnexinV-FIT/PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)成果與Hehst33258核染色成果相似(圖2)。圖1好別濃度6-HDA對(duì)N9D細(xì)胞凋亡的影響(Hehst33258核染色，Bar=20)A.一般比較組;B.溶劑比較組;L順次為1001000l/L6-HDA組;與一般比較組比較：*P0.01圖2好別濃度6-HDA對(duì)N9D細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞儀闡收成果A.一般比較組;B.溶劑比較組;L別離為1001000l/L6-HDA組;與一般比較組比較：*P0.013會(huì)商N(yùn)9D細(xì)胞系具有正在體多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的某些特征，如TH表達(dá)陽(yáng)性，

13、可以年夜要吸與、分解及釋放DA等，果此被廣泛利用于制做DA能神經(jīng)細(xì)胞毀傷的模型。6-HDA是一種神經(jīng)毒素，可以年夜要特同性天惹起DA能神經(jīng)細(xì)胞的毀傷，也常利用于PD模型的制做。本研討利用好別濃度的6-HDA做用于N9D細(xì)胞，沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察N9D細(xì)胞存活率戰(zhàn)凋亡率的變革，以期創(chuàng)制可以年夜要惹起必然數(shù)目細(xì)胞凋亡的最好濃度，為進(jìn)一步的研討創(chuàng)坐沒(méi)有變的離體細(xì)胞毀傷模型。過(guò)去文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中,但凡以DA能細(xì)胞緩性表露于6-HDA(248h)而創(chuàng)坐細(xì)胞的毀傷模型9-12。而比去研討覺(jué)得，6-HDA正在尺度做育形狀下5in內(nèi)即收逝世降解，那種降解很有年夜要收逝世陪陪的活性氧簇(reativexygenspei

14、es,RS)正在做育基中刪減。較少工夫表露于6-HDA的本代中腦細(xì)胞收逝世非特同性的毀傷。為了收逝世相似于PD中收逝世的細(xì)胞內(nèi)毀傷形式，6-HDA利用金屬離子螯開(kāi)劑戰(zhàn)抗氧化的維逝世素減無(wú)菌火配制，而且正在參減6-HDA前利用氮?dú)?N2)沖刷溶劑，那種處置懲獎(jiǎng)可以極年夜天抑制6-HDA的降解達(dá)30in8。果此，正在我們的嘗試中，一圓里根據(jù)上述要收配制6-HDA，另外一圓里限制6-HDA的表露工夫?yàn)?0in，以確保6-HDA對(duì)N9D細(xì)胞的毀傷做用是細(xì)胞內(nèi)收逝世RS的成果，而沒(méi)有是一樣仄常性的細(xì)胞毒性反響13。因?yàn)?-HDA那種快速降解的特征，嘗試中要供現(xiàn)配現(xiàn)用，可是，多么利用沒(méi)有但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)

15、形成6-HDA的極年夜黑費(fèi)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，將6-HDA按上述要收配制后，省去N2沖刷的歷程，活絡(luò)分拆熱躲置-80，經(jīng)由過(guò)程下效液相色譜-電化教要收(HPL)檢測(cè)創(chuàng)制6-HDA正在-80可以貯存6個(gè)月以上14，多么6-HDA的配制戰(zhàn)利用那么更減便當(dāng)。正在本研討中，我們利用3種自力的要收別離檢測(cè)6-HDA對(duì)N9D細(xì)胞存活戰(zhàn)凋亡的影響。TT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)的存活率，Hehst33258染色可以年夜要沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察到凋亡細(xì)胞核的特征，而AnnexinV-FIT/PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以區(qū)分壞逝世戰(zhàn)凋亡的細(xì)胞。3種要收檢測(cè)成果配開(kāi)闡收，N9D細(xì)胞的存活戰(zhàn)凋亡與6-HDA的毀傷做用呈濃度依好性閉連，正在

16、200l/L6-HDA做用30in、做育24h后，約37.8%的細(xì)胞凋亡，而且，正在此做用濃度下我們創(chuàng)制存活的N9D細(xì)胞形狀與一般比較組細(xì)胞形狀相似，暗示較好的存活形狀，繼盡按一般做育的要收做育，細(xì)胞可以年夜要安康逝世少。當(dāng)6-HDA的濃度正在300500l/L時(shí)，存活的細(xì)胞正在毀傷后繼盡做育23天約50%呈現(xiàn)逝世亡，而6-HDA濃度年夜于500l/L時(shí)，盡管仍按一般的要收做育，可是盡年夜年夜皆細(xì)胞正在毀傷的23天后緩緩趨于逝世亡。果此，為了進(jìn)一步研討對(duì)毀傷N9D細(xì)胞的庇護(hù)做用，我們挑選200l/L濃度的6-HDA創(chuàng)坐離體的細(xì)胞毀傷模型?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1hiHK,nLA,KnturPJ,etal

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