單細(xì)胞測序幫助文檔(科技代表)

1、華穴基因單細(xì)胞DNA測序幫助文檔人類群體與疾病研究業(yè)務(wù)線2011.11.15聲明：由于單細(xì)胞技術(shù)處于研發(fā)狀態(tài)，請注意保密，不要將資料外傳。一、技術(shù)概述2007年至今，以Illumina公司GenomeAnalyzer（GA）為代表的第二代測序平臺(tái)已經(jīng)大規(guī)模普及。同時(shí)，人類單倍型計(jì)劃、千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃、Meta-Hit計(jì)劃等重大國際合作項(xiàng)目也將基因組研究日漸推向高潮。然而，迄今為止使用的測序材料無一例外都是大量細(xì)胞的混合DNA樣本。在微生物生態(tài)學(xué)、癌癥基因組、法醫(yī)學(xué)、微量診斷、遺傳印記等研究中，這樣的材料顯然是無法滿足要求的，而單細(xì)胞微量測序?yàn)榻鉀Q以上難題打開了一扇嶄新的大門。單細(xì)

2、胞測序是指在單個(gè)細(xì)胞水平上對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)的建立需要兩個(gè)必備條件：（1）高質(zhì)量的全基因組擴(kuò)增技術(shù)（WholeGenomeAmplification,WGA）（2）高通量低成本的測序技術(shù)（NextGenerationSequencing,NGS）、技術(shù)應(yīng)用根據(jù)老師的樣本情況，可以針對性的選擇不同的研究方向，具體的樣品選擇和研究方案也有所不同。具體分為以下5種情況：微量、珍貴樣品（非單個(gè)細(xì)胞）：如胰腺癌、外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、冰凍切片研究癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制（分部位）研究治療前、后或不同時(shí)期癌癥變異情況（分時(shí)間點(diǎn)）針對有明顯亞型的癌癥研究（分區(qū)取樣）胚胎移植前診斷（PGD）

3、,主要用于遺傳性疾病的基因檢測其他需要在單個(gè)細(xì)胞水平研究的疾病三、技術(shù)詳解單細(xì)胞外顯子測序單細(xì)胞DNA測序目前只能做SNP或者CNV檢測，當(dāng)然一個(gè)細(xì)胞量太少，是不能同時(shí)檢測SNP和CNV的。單細(xì)胞外顯子測序是目前BGI做的比較多的，項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)比較豐富。其WGA技術(shù)擴(kuò)增錯(cuò)誤率僅為10-610-7,擴(kuò)增片段長（10kb）,因此全基因組覆蓋度比較好（細(xì)胞保存狀態(tài)好的情況下，可以達(dá)到85%甚至90%以上）。因此，該方法常用于SNP檢測。1）流程Agilent或Nimhlegen外顯子捕獲*SNP測及注秤卷變頻率各細(xì)屜的ilt化盤岳單細(xì)胞分離報(bào)解單細(xì)胞處理冷基因組擴(kuò)增-iH-DNA擴(kuò)増技術(shù)SOAP比對高通

4、顯測序序技術(shù)圖2單細(xì)胞外顯子測序流程2）測序策略91PE30 x（3）樣本量根據(jù)研究疾病不同，例如癌癥，一般取3-4個(gè)病灶（病灶數(shù)目隨樣品情況確定），每個(gè)病灶取30-50個(gè)單細(xì)胞。一個(gè)mixDNA作對照。（3）信息分析內(nèi)容基本信息分析：1）去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù)2）比對，產(chǎn)出數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)（基于第1條）3）SNP識(shí)別、注釋、統(tǒng)計(jì)（基于第1、2條）高級信息分析：根據(jù)疾病或樣品類型不同，高級信息分析內(nèi)容也不同，風(fēng)險(xiǎn)大，需要合作雙方商議確定。以癌癥為例：1）成對樣本（normal-tumor）SomaticSNP檢測、注釋及統(tǒng)計(jì)2）成對樣本（normal-tumor）SNV檢測、注釋及統(tǒng)計(jì)3）篩選出的

5、突變與已有數(shù)據(jù)庫的比較（cosmic,dbSNP等）4）氨基酸置換預(yù)測（SIFT，Polyphon-2）5）篩選出的基因的GO富集分析，Pathway富集分析6）識(shí)別drivergene刀癌癥亞細(xì)胞群群體分析（high-risk）華穴基因華穴基因4）案例CollaborativeprojectofBGIonsinglecellsequencingofseveralcancertypes（ongoing）Theresearcherssequencedtheexomesofseveralcommoncancerstoabout20-to40-foldcoverage,andrecoveredaro

6、und85%ofthetargetedregion.Theresearchersfoundthatthemajorityofmutationsinonecancertypewereofmediumfrequencyandlow-frequencymutationstendtoappearinkeycancergenesthatareassociatedwithresistancetotherapy.Builduptheprogressionmodeloftumorcellsandtracekeygenesforvarioussubpopulations.2.單細(xì)胞CNV檢測單細(xì)胞CNV檢測主要

7、用于：（1）客戶關(guān)注或與疾病相關(guān)的變異是CNV（2）細(xì)胞之間存在異質(zhì)性。與單細(xì)胞外顯子測序中使用的WGA技術(shù)相比，該WGA技術(shù)能夠?qū)θ蚪M進(jìn)行比較均勻的擴(kuò)增，因此適合CNV檢測，其缺點(diǎn)在于全基因組覆蓋度低（20%50%）。BGI有做過該方法的擴(kuò)增，但目前還沒有形成案例，因此以CSHL發(fā)表在nature上的文章作為案例說明一下這方面的應(yīng)用。案例（原文及具體解讀請見附件資料）：冷泉港實(shí)驗(yàn)室CSHL運(yùn)用單細(xì)胞測序的新技術(shù)，研究兩例乳腺癌病人的癌細(xì)胞群體關(guān)系NicholasNavinetal.Tumourevolutioninferredbysingle-cellsequencing.Nature（

8、2011）.012345.容U2.SPucp=QnLU/100個(gè)polygenomic癌細(xì)胞研究顯示：乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)亞群，并且這三個(gè)亞群是連續(xù)的克隆進(jìn)化關(guān)系ByUElM一p一urUJ100個(gè)monogenomic乳腺癌細(xì)胞研究表明：原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移癌來自同一個(gè)非整倍體的細(xì)胞克隆，該克隆轉(zhuǎn)移到其他部位，分化形成轉(zhuǎn)移癌二、送樣建議樣品鑒定：至少通過2個(gè)專業(yè)的病理學(xué)者對組織切片或細(xì)胞涂片進(jìn)行鑒定，同時(shí)對患者進(jìn)行確診。需照片記錄保存樣品收集：取樣量：所取實(shí)質(zhì)瘤樣品大小：0.1-0.5cm3（過大的樣品很可能不利于樣品的凍存，過小則不能滿足取樣用量）；血樣：10ml凍存：將組織和血樣直接放入-80C保存

9、，并在運(yùn)輸過程中使用干冰?？蛻艨筛鶕?jù)自己的需要使用不同的保護(hù)劑和凍存方法，同時(shí)給出保護(hù)劑成分和在有特殊要求時(shí)的解凍說明（保護(hù)劑成分可能影響測序），否則一律按照37度5分鐘水浴快速解凍處理運(yùn)輸將樣品保存于凍存管內(nèi)，用干冰運(yùn)輸。在運(yùn)前，請計(jì)算好路程和時(shí)間，放入足量的干冰，以免樣品損毀。由于液氮屬危險(xiǎn)品，快遞公司不允許運(yùn)輸，因此請勿在用液氮運(yùn)輸樣品。新鮮組織取樣后，凍存寄送所花費(fèi)時(shí)間盡量不超過3天。三、單細(xì)胞項(xiàng)目風(fēng)險(xiǎn)說明單細(xì)胞項(xiàng)目以合作為主。第一，單細(xì)胞測序?qū)儆谛录夹g(shù)，很多技術(shù)和信息分析還處于待完善階段，也沒有建立起完善的評價(jià)體系。因此，無法完全像商業(yè)化項(xiàng)目一樣。第二，單細(xì)胞測序以單個(gè)細(xì)胞為研究對象，個(gè)體是由大量細(xì)胞組成的，因此單細(xì)胞項(xiàng)目是以一群細(xì)胞為研究對象（30-50個(gè)單細(xì)胞/部位，需要選取多個(gè)不同部位），因此費(fèi)用大。第三，細(xì)胞和組織保DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD人類群體與疾病研究業(yè)務(wù)線口華穴基因華夭基因存的情況直接影響全基因組擴(kuò)增的效率，保存條件越好、越新鮮的單細(xì)胞其