發(fā)酵工程下游加工過程概論

1、第十二章 發(fā)酵工程下游加工過程簡介一、發(fā)酵工程下游加工過程概論 1、發(fā)酵工程下游加工過程的特點 1）所需產物在培養(yǎng)液中濃度較低，且穩(wěn)定性差2）普遍存在下游工程代價高，回收率較低等問題發(fā)酵液是復雜的多相系統2、發(fā)酵工程下游加工過程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預處理和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術加速固、液分離；如產物在細胞內，還要進行細胞破碎提?。ǔ醪郊兓┠康氖浅ヅc目標產物性質差異大的雜質精制（高度純化）是采用對產品有高度選擇性的分離技術，除去與產物化學性質和物理性質相近的雜質最終獲得質量合格的產品3、主要操作單元：絮凝離心過濾細胞破碎萃取沉淀層析結晶干燥二、發(fā)酵液預處理和過濾為什么要對發(fā)酵液

2、進行預處理？預處理的目的是什么？發(fā)酵液的基本特性 產物濃度低 具有極性 黏度大 表面張力大 性質不穩(wěn)定一）發(fā)酵液的預處理1、目的： 發(fā)酵液中雜質多且成分復雜，其中對純化影響最大的是高價無機離子(Ca 2+、Mg 2+、Fe 3+等)和雜蛋白等改變發(fā)酵液的物理性質，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產物轉入便于以后處理的相中；（一般為液相）能夠除去部分雜質。2、高價無機離子的去除鎂離子的去除： 常用草酸 與鈣離子生成草酸鈣沉淀 草酸為弱酸，對發(fā)酵產物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進蛋白質凝固，有利于提高濾液的過濾速度； 草酸的溶解度較小，需大用量時，可用草酸鈉取代；草酸價格較高，生產上一般需回

3、收鈣離子的去除：鐵離子的去除： 常用三聚磷酸鈉 與鎂離子形成可溶性絡合物 Na5P3O10 + Mg 2+ = MgNa3P3O10 + 2Na+常用黃血鹽 與鐵離子形成普魯氏藍沉淀3K4Fe(CN)6 + 4Fe 3+ = Fe4Fe(CN)63 + 12K+3、可溶性雜蛋白的去除 雜蛋白的存在會降低離子交換樹脂和大網格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會發(fā)生乳化，影響兩相分離。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時，還會使濾速下降，使膜受到污染。1）沉淀法 調等電點 因羧基的電離度比氨基大，所以大多數蛋白質的等電點都在酸性范圍(pH4.0-5.5) 但僅靠調等電點還不能使大部分蛋白質沉淀蛋白質是兩性物質，

4、在酸性溶液中，能與一些陰離子物質如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 3+、Pb 2+等 形成沉淀2）變性法 變性蛋白溶解度較小 最常用加熱法 加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率； 其他方法： 大幅度調節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑 變性法存在一定的局限 如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產物；極端pH也會導致某些目的產物失活，且需消耗大量酸堿，而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。3）吸附法 加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去 如四環(huán)素生產中，

5、采用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白； 在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去 凝聚和絮凝都是發(fā)酵液預處理的重要方法，其處理過程就是將化學藥劑預先投加到懸浮液中，改變細胞、菌體和蛋白質等粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。 發(fā)酵液預處理的方法凝聚和絮凝 凝聚指在投加的化學物質（如水解的凝聚劑：鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。 電解質的凝聚能力可用凝聚值表示，即使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質濃度（mmol/

6、L）。 一般反離子的價數越高，凝聚值越小，即凝聚能力越強。 如 Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 絮凝指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質）將膠體粒子交聯成網，形成10mm大小絮凝團的過程。 其中絮凝劑主要起架橋作用，工業(yè)上使用到的有聚丙烯酰胺類衍生物、聚合鋁鹽、海藻酸鈉、殼聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺類衍生物。1）板框(plate and frame)壓濾機板框過濾機結構圖 1-尾板 2-濾框 3-濾板 4-主梁 5-頭板 6-緊壓裝置二）發(fā)酵液過濾常用設備板框過濾機 Plate shifter1500 x 1500 Filter Press Cloth

7、washing1）板框(plate and frame)壓濾機2）帶式壓濾機二）發(fā)酵液過濾常用設備 發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進行補料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度； 菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產物增加發(fā)酵液黏度影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細胞體積 真菌菌絲體較粗大，發(fā)酵液不需特殊處理，易過濾； 放線菌菌絲細而分支，交織成網格狀，較難過濾， 發(fā)酵液需經預處理，凝固蛋白質等膠體物質，提高過濾速度； 細菌菌體更小，發(fā)酵液如不經絮凝等預處理，很難用常規(guī)過濾設備進行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會增加過濾難度3）放罐時機當發(fā)酵液中有不溶性多糖時，會使發(fā)酵液的黏度增

8、大而影響過濾速度；可用酶將其轉化成可溶性單糖，提高濾速。提高過濾性能的方法1）加助濾劑 助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速； 常用硅藻土、珍珠巖等； 加入方法有兩種：a)預先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑； b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3）酶解法（沉淀、吸附、萃取、超濾、結晶）發(fā)酵液初步純化細胞碎片分離細胞破碎細胞分離高度純化成品加工預處理胞外產物（加熱、調pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結晶、離子交換、色譜分離、膜分

9、離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞內產物提取精制產品的收得率和質量控制。細胞破碎 目的代謝產物并非都是分泌型的，許多是存在于細胞內的，特別是基因工程菌在細胞內形成的包含體是不分泌的，故需進行細胞破碎。 大規(guī)模破碎細胞常用方法； 利用高壓使細胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)，造成細胞破碎。 影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數1）高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2）高速球磨法高速球磨機1-物料進口 2-物料出口 3、4-冷卻水進、出口 5、6-夾套冷卻水進、出口由于圓盤的高速旋轉，細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細胞得以破碎。3）超聲波法 常用超聲波

10、頻率15-25kHz； 原理：由于超聲波產生極為強烈的沖擊波壓力，引起黏滯性旋渦在介質中的細胞上造成了剪切力，促使細胞內液體發(fā)生流動，造成細胞破碎； 超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時需冷卻； 通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4）酶解法 專一性強，條件溫和；但費用較高 酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用大多數微生物都能產生一種可以水解自身細胞壁的酶；當改變一定的環(huán)境條件，可誘發(fā)這種酶的過量產生或激發(fā)其他自溶酶產生，而發(fā)生自溶現象。5）滲透壓沖擊法 將細胞先放入高滲透壓的介質中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在達到平衡后，介質突然被稀釋，或將細胞轉入水或緩沖液中，水就會迅速進入細胞內，致

11、使細胞膨脹，引起細胞壁的破裂；此法適用于細胞壁較脆弱的，或者細胞壁預先用酶處理的，或細胞壁合成受到抑制的微生物；6）反復凍結-融化法 將細胞反復在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起細胞破裂；低溫冷凍一方面能使細胞膜的疏水鍵結構斷裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面胞內水結晶使細胞內外溶液濃度發(fā)生變化，引起細胞突然膨脹而破裂。 該法適用于細胞壁較脆弱的細胞細胞破碎方法二、提?。ǔ醪椒蛛x）（一）沉淀法（Precipitation） 沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質由液相轉變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。 方法簡單、成本低、使用廣泛，初步分離的常用手段。鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法非離子型聚

12、合物沉淀法聚電解質沉淀法生成鹽復合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法 中性鹽的加入能破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質的溶解度降低而析出。1.鹽析法 (Salting out) 破壞了蛋白質在水中存在的兩個因素(水化層和電荷),從而使蛋白質沉淀。將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。 蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 鹽溶(salting in)： 許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現象（比在純水中的溶解度大大增加）；高鹽濃度則鹽析，離子強度越大，蛋白質

13、的溶解度越低；由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。1）蛋白質濃度蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。 2）離子強度和種類3）溫度 溫度是影響溶質溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機鹽和小分子有機化合物的溶解度；4）pH 由于蛋白質在等電點時最易沉淀，故可選擇等電點的pH作為鹽析pH影響鹽析的因素2.等電點沉淀法原理：利用兩性電解質在電中性時溶解度最低優(yōu)點：許多蛋白的等電點都在偏酸范圍內

14、，而許多無機酸的價格低廉；缺點：酸化時易引起蛋白失活 不少蛋白質與金屬結合后會發(fā)生等電點偏移，如胰島素的等電點為5.3，在與Zn 2+結合形成胰島素鋅鹽，其等電點升為6.2；故加入金屬離子后選擇等電點沉淀時，要注意調整pH。二、提?。ǔ醪椒蛛x）（二）結晶法（crystallization） 物質從液態(tài)（液體或熔融體）或氣態(tài)形成晶體的過程叫結晶。 加入能使結晶溶質溶解度降低的物質，讓結晶溶質形成過飽和液；例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脫色液中加入終濃度為60%-80%的乙醇，就結晶析出;在普魯卡因青霉素結晶時，加入一定量的食鹽，可使結晶更易析出結晶方法 （過飽和溶液形成的方法）1）濃縮結晶減

15、壓蒸發(fā)濃縮，達到過飽和2）冷卻結晶適用于溶解度隨溫度變化很大的物質；先加熱使其溶解，然后冷卻結晶；3）化學反應結晶 加入反應劑或調pH，使生成更低可溶性物質； 如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加入乙醇-醋酸鉀，因形成的青霉素鉀鹽難溶于醋酸丁酯而結晶析出。4）解析結晶（drowningout）三、精制（高度純化）（一）離子交換法 (Ion exchange)離子交換工作原理 根據物質的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子不同，電荷不同的物質對層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變洗脫液的離子強度或pH，不同物質就能依次從層析柱中分離出來。 在離子交換過程中，離子首先擴散到樹脂表面，通過樹脂擴散到交換位置，在交換位置進行離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹脂的結合越緊密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子擴散到樹脂表面，洗脫液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。三、精制（高度純化）（二）色譜分離法用微量注射器針頭或微細管把樣品點一小點在層析床的一端。要