DNA的定量實驗原理及步驟

1、實驗七 DNA的定量一、 實驗原理核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。1 OD260相當(dāng)于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛?。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為2.0, 若DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。對于很稀

2、的核酸溶液，可用熒光光度法進(jìn)行測定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強(qiáng)度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)15ng。由于是基于目測，所以是估計水平。 該方法經(jīng)濟(jì)簡便，但準(zhǔn)確性較低。二、儀器及試劑1. 儀器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。2. 試劑及配制： 5上樣緩沖液：配制10 ml 0.5 mol/L

3、 EDTA(pH8.0) 2 ml10% SDS 50 ul50% 甘油 2.5 ml0.2% 溴酚藍(lán) 10 mg0.2% 二甲苯青FF 10 mg加去離子水至10 ml 其它試劑：0.1TE 、DNA標(biāo)準(zhǔn)液，EB儲存液（10 mg/ml），三、實驗步驟1.紫外分光光度法（1）用0.1TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。（2）開機(jī)，儀器會自動對光路及分析軟件進(jìn)行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時，進(jìn)入核酸測定窗口（3）調(diào)零。先用0.1TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。

4、（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用57ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個待測樣品。（6）DNA純度：以O(shè)D260/ OD280比值來反映。當(dāng)OD60 /OD80比值 2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。2. EB熒光分析法（1）瓊脂糖凝膠的制備。（2）樣品的準(zhǔn)備。把待測DNA

5、樣品進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋，并準(zhǔn)備一份DNA標(biāo)準(zhǔn)液作對照。（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴(yán)重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。四、常見問題1 紫外分光光度法不能區(qū)分DNA分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體DNA和RNA等。由于測定吸收光度A260時，難以排除RNA、染色體DNA、以及DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實際濃