同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科ISO15189體系文件14細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)（儀器法）

1、同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物組項(xiàng)目操作指導(dǎo)書TJYYJYKWSW/XMZ114第2版標(biāo)題：細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)（儀器法）第1章 第14號(hào)第 PAGE 8 頁(yè) 共 NUMPAGES 8 頁(yè)1 VITEK-32 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng):1.1 基本原理: 參見：“VITEK-32全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序”。1.2 基本結(jié)構(gòu):1.2.1 菌液充填裝置: 為一真空倉(cāng)，試管中的菌懸液用彎塑料管與測(cè)試卡進(jìn)樣孔相連，真空倉(cāng)的負(fù)壓可使菌液充入測(cè)試卡內(nèi)。采用塑料頭將充完菌液的試卡密封。1.2.2 讀數(shù)器/孵箱:由計(jì)算機(jī)控制下的孵箱，帶有一光電比色讀數(shù)頭。讀數(shù)器采用665nm波長(zhǎng)的光掃描器，孵育箱內(nèi)

2、的直立圓柱轉(zhuǎn)盤每隔90o置一卡片架位，共可放個(gè)卡片架，每個(gè)架子可放張卡片，總數(shù)為32張。1.2.3 工作站:VITEK系統(tǒng)是采用IBM公司所生產(chǎn)的RISC6000工作站來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集分析及儲(chǔ)存40000名以上受檢者的人口統(tǒng)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有多種媒體拷貝數(shù)據(jù)，采用圖示軟件、鼠標(biāo)操作。計(jì)算機(jī)軟件包括處理軟件、專家系統(tǒng)軟件及藥品管理軟件等。具有28種流行病學(xué)和統(tǒng)計(jì)報(bào)告，包括菌種發(fā)生率、敏感率統(tǒng)計(jì)、抗生素累積敏感性、敏感率累積MIC報(bào)告、每月細(xì)菌發(fā)生率、每月細(xì)菌敏感率、工作量、生物模式統(tǒng)計(jì)，以及根據(jù)不同測(cè)試卡種類統(tǒng)計(jì)的敏感率等報(bào)告。每一種報(bào)告有41種可變參數(shù)，根據(jù)不同目的，改變某一參數(shù)時(shí)即可產(chǎn)生不同的流

3、行病學(xué)報(bào)告。1.2.4 測(cè)試卡: 含有鑒定卡10種，包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌、厭氧菌、嗜血桿菌、奈瑟菌、腸道致病菌、芽胞桿菌、非發(fā)酵革蘭陰性菌和快速革蘭陰性桿菌鑒定卡GNI。還有尿標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)和鑒定，含有各種不同抗生素組合的藥敏試卡共26種、其中革蘭陰性桿菌的藥敏試卡20余種，革蘭陽(yáng)性菌藥敏試卡3種，還有尿道分離菌的藥敏試卡，超廣譜B-內(nèi)酰胺酶測(cè)試卡等1.3 操作要點(diǎn)1.3.1 制備菌液: 按不同測(cè)試卡的要求，配制不同濃度的純的菌懸液，如GPI需0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?、GNI 個(gè)麥?zhǔn)蠁挝弧BC 2個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?、ANI 3個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?、GNS從1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙喝?0ul加入1.8ml無(wú)菌鹽水

4、中,GNS從0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙喝?00ul加入1.8ml無(wú)菌鹽水中。1.3.2 菌液接種與封口。1.3.3 將測(cè)試卡置入讀數(shù)器/孵箱。1.3.4 輸入受檢者資料。1.3.5 自動(dòng)打印實(shí)驗(yàn)室和臨床報(bào)告。1.4 功能與特點(diǎn)1.4.1 鑒定功能: 快速鑒定革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性細(xì)菌、苛氧菌、厭氧菌和酵母菌等500種臨床病原菌。1.4.2 藥敏試驗(yàn): 具有20多種藥敏試卡、97種抗生素和測(cè)定超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）測(cè)試卡，快速檢測(cè)細(xì)菌藥敏情況。 1.4.3 動(dòng)態(tài)分析原理提供最佳狀態(tài)的特異性和敏感性，鑒定速度增快。1.4.4 軟件系統(tǒng)設(shè)有質(zhì)控和專家系統(tǒng)可針對(duì)鑒定和藥敏結(jié)果人工智能分析。1.5 質(zhì)量

5、控制1.5.1 質(zhì)控菌株: 金黃色葡萄球菌ATCC29213，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。1.5.2 質(zhì)控方法: 將質(zhì)控菌株接種M-H平板，培養(yǎng)過(guò)夜，與測(cè)試標(biāo)本一樣操作接種藥敏卡。要求測(cè)試結(jié)果( MIC)符合NCCLS規(guī)定的范圍。如表1、表2所示。1.5.3 VITEK 系統(tǒng)質(zhì)控軟件操作1.5.3.1 設(shè)置QC 到系統(tǒng)的主菜單界面中點(diǎn)擊VITEK，再點(diǎn)擊SUT UP在里面找到Transfer Finalized Card to Quality Control System把前面的按鈕點(diǎn)下去，然后保存退出，順序如下：viteksetupconfiguration

6、點(diǎn)中Transfer Finalized Card to Quality Control SystemSaveQuit。1.5.3.2 輸入QC的資料 點(diǎn)擊QC到下拉菜單進(jìn)入Reference里，在TEST TYPE里輸入藥敏卡片的類型，在ORGANISM ATCC后面點(diǎn)擊？選進(jìn)行質(zhì)控藥敏卡的標(biāo)準(zhǔn)菌株，然后在RERRENCE NUMBER里輸入平時(shí)用不到的號(hào)碼（一種藥敏卡、一種細(xì)菌一個(gè)號(hào)），然后保存退出。按下面順序進(jìn)行：QcReferenceTest TypeOrganism ATCCReference NumberSaveQuit.1.5.3.3 輸入卡片資料 點(diǎn)擊QC,點(diǎn)擊LOT MAIN

7、TENANCE的TEST TYPE里輸入藥敏卡的類型，在LOT NUMBER輸入包裝盒上的貨號(hào)，然后在ISOLATE NUMBER點(diǎn)下拉菜單選0，在把下面所有要求填寫日期的空框里填寫日期，在NUMBER RECEIVED里填寫購(gòu)買該卡片的數(shù)量（盒）。 QcLot MaintenanceTest TypeLot NumberIsolate Number 點(diǎn)下拉菜單選0填寫下面所有要求填寫日期的空框Number Received訂貨量。1.5.3.4 查看QC 點(diǎn)擊QC在VIEW RESULT里查看已做過(guò)的QC資料。1.5.3.5 注意事項(xiàng) 所有QC資料只有在卡片進(jìn)入機(jī)器前進(jìn)行輸入，如結(jié)果報(bào)出卡片

8、取出則無(wú)法輸入已做完的QC資料。表1 GNS-121 測(cè)試質(zhì)控菌株預(yù)期結(jié)果大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單胞菌ATCC27853阿米卡星2-82-4阿莫西林/克拉維酸832氨芐西林2-832頭孢唑啉832頭孢替坦1664頭孢他啶88頭孢曲松88-64環(huán)丙沙星0.50.5-1慶大霉素0.5-10.5-2亞胺培南44左氧氟沙星11-2呋喃妥因32128哌拉西林/三坐巴坦88妥布霉素0.5-10.5-1甲氧芐啶/磺胺甲惡唑10160-320ESBL（CTX）NEG 表2 GPS-110測(cè)試質(zhì)控菌株預(yù)期結(jié)果 抗菌素金黃色葡萄球菌ATCC29213糞腸球菌ATCC29212氨芐西林/舒巴坦4頭孢唑啉

9、8克林霉素0.54-8紅霉素0.5-11-4慶大霉素2慶大霉素500-SYN-S左氧氟沙星力奈唑烷莫昔沙星12-40.251-22-40.25-0.5呋喃妥因3232苯唑西林0.25-0.5青霉素G16+1-4利福平1鏈霉素2000-SYN-S四環(huán)素18-16甲氧芐啶/磺胺甲惡唑1010萬(wàn)古霉素0.5-21-4B-內(nèi)酰胺酶POS2. API 微量鑒定系統(tǒng):2.1 鑒定原理: API試條中的小孔內(nèi)含有微量生化反應(yīng)試劑，加入一定濃度的待檢菌液后，在一定條件（35）下孵育一定時(shí)間（2-24H）,基質(zhì)的顏色即可發(fā)生改變，依據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)碼（每3個(gè)生化反應(yīng)為一組，第1項(xiàng)反應(yīng)陽(yáng)性為“

10、4”， 第2項(xiàng)反應(yīng)陽(yáng)性為“2”， 第3項(xiàng)反應(yīng)陽(yáng)性為“1”，各項(xiàng)反應(yīng)陰性記為“0”，將每組3項(xiàng)反應(yīng)的陰、陽(yáng)性結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)值并相加得到一組編碼，查詢菌碼索引手冊(cè)或判讀軟件得出鑒定結(jié)果。2.2 基本組成:2.2.1 各種類型的API板條: API 20E鑒定腸桿菌科細(xì)菌；API 20NE鑒定非腸桿菌科革蘭陰性菌；API Staph鑒定葡萄球菌屬和微球菌屬；API Strep鑒定鏈球菌屬；API Coryne鑒定棒狀桿菌屬；API 50CHB鑒定芽胞桿菌屬等革蘭陽(yáng)性桿菌；API NH鑒定奈瑟菌屬、布蘭漢菌屬和嗜血桿菌屬；API Campy鑒定彎曲桿菌和螺桿菌；API 20A鑒定厭氧菌。2.2.3 配套

11、試劑: 氧化酶、吲哚、VP和硝酸鹽試劑等。2.2.4 菌碼索引手冊(cè)或API LAB判讀軟件。2.3 操作要點(diǎn): 挑取純菌落制備菌懸液，接種至API條板的小孔內(nèi)，將ADH、LDC、ODC、URE和H2S加滿石蠟油，35孵育18-24h，判定并記錄數(shù)碼，查閱API編碼手冊(cè)得出鑒定結(jié)果。 功能特點(diǎn):具有簡(jiǎn)易化、微量化、系統(tǒng)化、商品化和表準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。3 其它生化鑒定試驗(yàn)（手工）3.1 吲哚試驗(yàn)3.1.1 原理：細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚，吲哚可與試劑中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。3.1.2 方法：待檢菌接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)過(guò)夜，沿管壁徐徐加入Kovac氏試劑約0.5m

12、l使成兩層，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。3.1.3 用途：主要用于腸桿菌科細(xì)菌鑒定用。3.1.4 注意事項(xiàng)：蛋白胨必須含色氨酸。 Kovac 氏試劑應(yīng)保存于帶玻璃蓋的棕色瓶中。時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則敏感度降低。有些細(xì)菌如黃桿菌產(chǎn)吲哚量少，必須用二甲苯或乙醚提取濃縮后才能與吲哚試劑起反應(yīng)，否則就難以檢出。3.1.5 質(zhì)量控制：大腸埃希菌：陽(yáng)性； 肺炎克雷伯菌：陰性3.2 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)3.2.1 原理：H2O2 在過(guò)氧化氫酶催化下產(chǎn)生水，同時(shí)釋放出O2。3.2.2 試劑：3 % H2O2 溶液。置棕色瓶?jī)?nèi)于4暗處保存。3.2.3 方法：挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的玻片上，滴加3 %

13、 H2O2溶液12滴。1分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽(yáng)性，不產(chǎn)氣泡為陰性。3.2.4 注意事項(xiàng)：注意H2O2為3 %，用商品30 % H2O2時(shí)應(yīng)稀釋10倍；不允許在培養(yǎng)基上做試驗(yàn)。每次試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)以陽(yáng)性和陰性菌株做對(duì)照。3.2.5 質(zhì)量控制：金黃色葡萄球菌：陽(yáng)性； 草綠色鏈球菌：陰性3.3 血漿凝固酶試驗(yàn)3.3.1 原理：致病性葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌的表面，產(chǎn)生凝固。葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，可用玻片法測(cè)出；另一種是菌體生成后釋放于培養(yǎng)基中，叫做游離凝固酶，可用試管法測(cè)出。3.3.2 方法3.3.2.1 玻片法：取一滴生理鹽水于

14、潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于鹽水中，制成濃的菌懸液，無(wú)自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)血漿混合，立即觀察結(jié)果，出現(xiàn)明顯凝快為陽(yáng)性，否則為陰性。 注意： 立即觀察結(jié)果。 必須制備很濃的菌懸液。 血漿以EDTA抗凝的兔血漿為最好。3.3.2.2 試管法：用生理鹽水將血漿41稀釋，取0.5mL。然后挑取3-5個(gè)菌落于稀釋血漿中，制成濃菌液。置37水浴34小時(shí)觀察結(jié)果，凝固者為陽(yáng)性。觀察到24小時(shí)，不凝固者為陰性。試驗(yàn)時(shí)應(yīng)同時(shí)作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。3.3.3 質(zhì)量控制：金黃色葡萄球菌：陽(yáng)性；表皮葡萄球菌：陰性3.4 膠乳凝集法快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌(商品試劑盒)3.4.1 原理 Slidex Staph

15、Plus 膠乳凝集試劑采用了包被有人類纖維蛋白原和單克隆抗體的藍(lán)色膠乳顆粒，因此可同時(shí)檢出：凝集因子、蛋白A、周邊莢膜上的特異抗原。由金黃色葡萄球菌引起的陽(yáng)性反應(yīng)將產(chǎn)生肉眼可辨的膠乳凝集顆粒。3.4.2 操作方法3.4.2.1 取反應(yīng)卡片一張，選擇兩個(gè)相鄰的反應(yīng)圈，標(biāo)注編號(hào)，其中一個(gè)反應(yīng)圈加入一小滴試劑R1, 另一個(gè)反應(yīng)圈加入一小滴試劑R2。3.4.2.2 分別使用二根不同的攪拌棒或塑料接種環(huán)取菌落于環(huán)內(nèi)，均勻混合菌落和試劑10秒，并將膠乳試劑在整個(gè)反應(yīng)圈鋪開，緩緩搖動(dòng)反應(yīng)卡20秒，觀察有無(wú)膠乳凝集產(chǎn)生。3.4.2.3 在30秒內(nèi)，R1反應(yīng)圈凝集， R2反應(yīng)圈不凝集為陽(yáng)性，均不凝集為陰性。R2

16、反應(yīng)圈出現(xiàn)凝集，反應(yīng)無(wú)效。3.4.3 質(zhì)量控制：金黃色葡萄球菌：陽(yáng)性；表皮葡萄球菌：陰性3.5 CAMP試驗(yàn)3.5.1 原理：B群鏈球菌產(chǎn)生一種“CAMP”因子，此物質(zhì)能促進(jìn)葡萄球菌的溶血素的活性。因此可在兩種細(xì)菌的交界處溶血力增強(qiáng)，出現(xiàn)箭頭型的透明溶血區(qū)。3.5.2 方法：首先在血平板上接種一長(zhǎng)條金黃色葡萄球菌，再將被檢菌與金黃色葡萄球菌接種線垂直接種一短線，兩者間距離3mm左右。同時(shí)在被檢菌接種線對(duì)側(cè)，以金黃色葡萄球菌接種線為對(duì)稱軸，用同樣的方法接種陰性和陽(yáng)性對(duì)照菌。35 孵育過(guò)夜。在被檢菌接種線與金黃色葡萄球菌接種線之間有一個(gè)箭頭形溶血區(qū)，CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性。3.5.3 質(zhì)量控制：B群鏈球

17、菌：陽(yáng)性； A群鏈球菌：陰性3.6 氧化酶試驗(yàn)3.6.1 原理：氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)的結(jié)果又與細(xì)胞色素的存在有關(guān)。3.6.2 材料：直徑6mm左右新華定性濾紙片。將濾紙片在 鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液中浸泡約5min取出，置35溫箱烘干，剪成細(xì)條狀，防潮保存。3.6.2 方法：取氧化酶紙片一張，輕輕刮取平板上的菌落，紙張變紅為陽(yáng)性，不變色為陰性。3.6.4 注意事項(xiàng)：試驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。3.6.5 對(duì)照：陽(yáng)性菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853，陰性菌株：大腸埃希氏菌ATCC259223.7 鹽酸乙基氫化羥基奎寧（optochin） 敏感試驗(yàn)3.7.1 原理： optochin 即乙基氫化銅蛋白，從結(jié)構(gòu)上看類似奎寧，故有人又稱其為鹽酸乙基氫化羥基奎寧。 該藥物對(duì)肺炎鏈球菌的作用機(jī)制很可能是干擾葉酸的生物合成，但由于藥物本身有強(qiáng)烈的毒素，故僅可用于臨床細(xì)菌學(xué)的